筛选与验证CARMN表达
鉴定与CLTI相关的差异表达lncRNA，并验证CARMN在患者和小鼠模型中的表达变化。
对缺氧刺激的平滑肌细胞和CLTI患者腓肠肌进行RNA-seq，取交集确定CARMN；通过RT-qPCR和RNA-FISH验证其表达和定位。
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平滑肌细胞lncRNA通过miR-143-3p/HHIP信号调控慢性肢体威胁性缺血中的血管生成
A smooth muscle cell lncRNA controls angiogenesis in chronic limb-threatening ischemia through miR-143-3p/HHIP signaling
实验完整度
高包含体外细胞实验、体内小鼠模型及患者样本分析，涵盖功能验证（如增殖、成管、血流恢复）和机制验证（如RNA-seq、荧光素酶报告基因、siRNA/mimic挽救实验）。
主要模型
小鼠原代主动脉平滑肌细胞 小鼠原代内皮细胞（mECs） Carmn基因敲除小鼠（后肢缺血模型） 人腓肠肌活检样本（CLTI患者与非PAD对照）
重点核对
CARMN在CLTI患者腓肠肌中表达下调（RNA-seq和RT-qPCR） Carmn-KO小鼠在股动脉结扎后血流恢复受损、毛细血管密度降低 CARMN-KO平滑肌细胞上清液抑制内皮细胞增殖和血管生成 miR-143-3p靶向Hhip 3'UTR（荧光素酶报告基因验证） 递送si-Hhip或miR-143-3p模拟物可挽救血流恢复
摘要
外周动脉疾病（PAD）常进展为慢性肢体威胁性缺血（CLTI），导致肢体截肢等严重并发症。尽管治疗性血管生成具有潜力，但驱动PAD的细胞间通讯和转录变化机制尚未完全阐明。对有无CLTI参与者腓肠肌的长链非编码RNA（lncRNA）分析显示，一种血管平滑肌细胞富集的lncRNA CARMN在CLTI中表达降低。本研究探讨了平滑肌细胞lncRNA-miRNA信号轴如何调节肢体缺血中的血管生成。CARMN-KO小鼠在肢体缺血后表现出毛细血管密度降低、血流恢复受损和组织坏死。我们发现CARMN-KO平滑肌细胞上清液抑制内皮细胞（EC）增殖、球体出芽和网络形成。RNA-seq鉴定出CARMN-KO模型中Hedgehog信号通路下调，并揭示CARMN通过其下游miRNA miR-143-3p调控该通路，miR-143-3p靶向Hedgehog相互作用蛋白（HHIP），即Hedgehog信号的拮抗剂。递送HHIP特异性siRNA或miR-143-3p模拟物可挽救EC血管生成缺陷，并改善CARMN-KO和WT小鼠的血流恢复。这些发现强调了CARMN通过miR-143-3p-HHIP-Hedgehog信号轴调节血管生成的关键作用，为平滑肌细胞-内皮细胞相互作用和CLTI的潜在治疗策略提供了见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 平滑肌细胞富集的lncRNA CARMN如何通过细胞间通讯调控肢体缺血中的血管生成？
- 核心机制
- CARMN作为miR-143-3p的宿主基因，促进miR-143-3p表达，后者直接靶向Hhip 3'UTR抑制其表达，从而解除HHIP对Hedgehog信号通路的抑制，促进血管生成。
- 主要证据
- 体外实验显示CARMN-KO平滑肌细胞上清液抑制内皮细胞增殖、球体出芽和网络形成；体内实验显示Carmn-KO小鼠血流恢复受损、毛细血管密度降低；miR-143-3p模拟物或si-Hhip递送可挽救这些表型。
- 研究意义
- 揭示了平滑肌细胞-内皮细胞旁分泌通讯在缺血肢体血管生成中的重要作用，为CLTI治疗提供了靶向CARMN-miR-143-3p-HHIP信号轴的潜在策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估Carmn-KO小鼠体内表型
确定Carmn缺失对后肢缺血后血流恢复和血管生成的影响。
对Carmn-WT和KO小鼠进行股动脉结扎，通过激光多普勒、免疫荧光、H&E和Masson染色评估血流、毛细血管密度、坏死和纤维化。
体外研究平滑肌细胞-内皮细胞旁分泌效应
探究Carmn缺失的平滑肌细胞通过旁分泌对 endothelial 细胞功能的影响。
收集Carmn-WT和KO平滑肌细胞上清液，用于处理内皮细胞，检测增殖、通透性、球体出芽、网络形成和信号通路激活。
转录组学和通路分析
揭示Carmn缺失影响的下游信号通路。
对Carmn-WT和KO平滑肌细胞及后肢缺血小鼠腓肠肌进行RNA-seq，分析差异表达基因和通路富集。
验证Hhip表达和分泌
确认Carmn缺失导致Hhip表达和分泌增加。
通过RT-qPCR、Western blot、ELISA和免疫荧光检测Hhip在mRNA和蛋白水平的表达。
机制研究：miR-143-3p靶向Hhip
证实CARMN通过miR-143-3p调控Hhip表达。
使用预测算法、miRNA抑制剂/模拟物转染、荧光素酶报告基因实验验证miR-143-3p对Hhip的直接调控。
体内挽救实验
验证si-Hhip或miR-143-3p模拟物递送是否能改善Carmn-KO小鼠的缺血表型。
在后肢缺血小鼠的腓肠肌内注射si-Hhip或miR-143-3p模拟物，评估血流恢复、坏死、毛细血管和动脉密度。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 组织活检 | BD Elevation乳房活检系统 | BD | -- |
| RNA提取 | Direct-zol RNA小量制备试剂盒 | Zymo Research | R2052 |
| 细胞培养 | 内皮细胞生长培养基 | Cell Biologics | M1168 |
| DMEM培养基 | Gibco | 10566-016 | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596-026 |
| RNA质量检测 | NanoDrop 2000分光光度计 | ThermoFisher | -- |
| RT-qPCR | miRCURY LNA逆转录试剂盒 | Qiagen | 339340 |
| MiRCURY LNA SYBR Green PCR试剂盒 | Qiagen | 339346 | |
| Quantstudio 6 Pro实时荧光定量PCR仪 | ThermoFisher | -- | |
| High-Capacity cDNA逆转录试剂盒 | ThermoFisher | 4368814 | |
| GoTaq qPCR预混液 | Promega | 0000599886 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | ThermoFisher Scientific | -- |
| PVDF膜 | Bio-Rad | -- | |
| HHIP抗体 | Proteintech | 29466-1-AP | |
| GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | D16H11 | |
| PTCH1抗体 | Santa Cruz | sc-518102 | |
| SMO抗体 | Santa Cruz | sc-166685 | |
| Gli1抗体 | Proteintech | 66905-1-Ig | |
| 磷酸化AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 4060S | |
| AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 4691S | |
| 磷酸化eNOS（Thr495）抗体 | Proteintech | 28939-1-AP | |
| eNOS抗体 | Cell Signaling Technology | 32027S | |
| 抗兔IgG HRP偶联二抗 | Cell Signaling Technology | 7074 | |
| Chemidoc化学发光成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| RNA免疫沉淀 | 二硫苏糖醇 | ThermoFisher | P2325 |
| RNase抑制剂 | ThermoFisher | 10777019 | |
| 无EDTA蛋白酶抑制剂混合物 | ThermoFisher | PI78441 | |
| SRF抗体 | Cell Signaling Technology | 5147 | |
| IgG同型对照抗体 | Millipore | PP64B | |
| Pierce蛋白A/G磁珠 | ThermoFisher | 88802 | |
| RNA测序 | Illumina HiSeq2500测序仪 | Illumina | -- |
| 药物处理 | GANT61（Hedgehog信号通路抑制剂） | -- | -- |
| 血管内皮生长因子 | -- | -- | |
| 细胞转染 | Hhip siRNA | Dharmacon | 240617 |
| 非特异性对照siRNA | Dharmacon | 3391201 | |
| miR-143-3p抑制剂 | ThermoFisher Scientific | MH10883 | |
| miR-145-3p抑制剂 | ThermoFisher Scientific | MH13036 | |
| miR-143-3p模拟物 | ThermoFisher Scientific | MC10883 | |
| miR-145-5p模拟物 | ThermoFisher Scientific | MC11480 | |
| 动物手术 | 7-0普理灵缝线 | -- | -- |
| 激光多普勒成像仪 | Moor Instruments | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 小鼠原代内皮细胞（mECs）培养基（Cell Biologics M1168），平滑肌细胞培养基（DMEM含10% FBS和1% P/S），细胞传代次数（≤6次） 阅读提示：Methods - Cell culture and transfection |
| 细胞转染 | miRNA抑制剂/模拟物浓度（100 nM），siRNA浓度（100 nM），转染试剂（Lipofectamine 2000） 阅读提示：Methods - Cell culture and transfection |
| 动物模型 | 小鼠品系（CARMN+/+和CARMN–/–，The Jackson Laboratory），年龄匹配，股动脉结扎手术具体步骤，术后时间点（0、3、11、31天） 阅读提示：Methods - Animal studies, Hindlimb ischemia mouse models |
| 体内递送 | si-Hhip或miR-143-3p模拟物的注射剂量、注射时间点（术后立即及14天内共4次）、注射方式（肌肉注射） 阅读提示：Figure 9, Figure 10 legends, Methods - Hindlimb ischemia mouse models |
| 机制研究 | miR-143-3p靶向Hhip 3'UTR的种子序列，荧光素酶报告基因实验的具体条件（转染比例、检测时间） 阅读提示：Figure 8 legend, Methods - Cell culture and transfection |