构建条件性敲除小鼠模型
评估UTX在T细胞中表达对T1D发生的影响。
通过杂交UTXfl/fl与Lck-Cre小鼠，在NOD背景下生成T细胞特异性UTX敲除小鼠（NOD-UTXTCD），并以同窝对照NOD-WT作为对照。
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UTX与TCF1和STAT3协同控制自身免疫性糖尿病中祖细胞CD8+ T细胞的命运
UTX coordinates TCF1 and STAT3 to control progenitor CD8+ T cell fate in autoimmune diabetes
实验完整度
高研究包含T细胞特异性UTX敲除小鼠模型、单细胞RNA测序、流式细胞术、ATAC-seq、RNA-seq、CUT&Tag、体外共免疫沉淀以及人类CD8+ T细胞CRISPR编辑等多层级实验验证，并进行了功能验证和机制验证。
主要模型
NOD小鼠 NOD-SCID小鼠 NOD-TCR 8.3转基因小鼠 人CD8+ T细胞（来自T1D患者PBMC）
重点核对
UTX在T细胞中的特异性缺失（NOD-UTXTCD小鼠） UTX去甲基化酶活性（NOD-UTXDMD小鼠） CD8+ T细胞亚群鉴定：Tprog（Ly108+CD39-）和Tmed（Ly108-CD39+） IGRP特异性CD8+ T细胞（NRP-V7四聚体）
摘要
1型糖尿病（T1D）是一种由自身免疫系统持续攻击胰腺β细胞引起的慢性疾病。这种自身免疫的慢性持续性是由干细胞样祖细胞CD8+ T细胞介导的，它们不断补充β细胞特异性细胞溶解效应细胞的库。然而，控制祖细胞向效应细胞转化的因素仍不清楚。T1D与包含表观遗传调节因子UTX的染色体区域（Xp13-p11）有关，这表明UTX在T1D发病机制中起关键作用。在此，我们证明在NOD小鼠中T细胞特异性UTX缺失可防止T1D的发生。在NOD小鼠和T1D患者的T细胞中，UTX消融导致CD8+祖细胞积累，同时效应细胞减少，表明UTX在使祖细胞向效应细胞转变中发挥关键作用。在机制上，UTX在T1D中的作用与其固有的组蛋白去甲基化酶活性无关，而是依赖于与转录因子（TCF1和STAT3）结合，共同调节对CD8+祖细胞的维持和分化至关重要的基因。总之，这些发现确定了UTX在T1D中的关键作用，并将UTX:TCF1:STAT3复合物作为终止长期自身免疫反应的治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- UTX是否以及如何调控自身免疫性糖尿病中CD8+ T细胞的祖细胞向效应细胞转变？
- 核心机制
- UTX与转录因子TCF1和STAT3形成复合物，共同调控祖细胞和效应基因位点的染色质可及性和转录，从而驱动CD8+ T细胞从干细胞样祖细胞向细胞溶解效应细胞转变。
- 主要证据
- 基于NOD小鼠模型、单细胞RNA测序、ATAC-seq、RNA-seq、CUT&Tag、共免疫沉淀及人CD8+ T细胞基因编辑实验，证实UTX-TCF1-STAT3复合物调控CD8+ T细胞分化。
- 研究意义
- 为终止长期自身免疫反应提供潜在治疗靶点，即UTX:TCF1:STAT3复合物。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
表型分析与免疫细胞表征
确定UTX缺失对糖尿病发生和免疫细胞亚群分布的影响。
监测糖尿病发病率，进行胰腺组织学评分；分离胰腺淋巴结（pLN）免疫细胞进行单细胞RNA测序和流式细胞术分析。
功能验证
验证UTX在CD8+ T细胞祖细胞向效应细胞转变中的功能作用。
采用过继转移实验，将IGRP特异性Tprog细胞转移到免疫缺陷受体小鼠，并评估CD8+ T细胞亚群分布。
机制研究
揭示UTX调控CD8+ T细胞分化的分子机制。
对分选后的pLN CD8+ Tprog细胞进行ATAC-seq、RNA-seq和CUT&Tag分析，结合公共ChIP-seq数据，并进行共免疫沉淀验证UTX与TCF1/STAT3的相互作用。
人源验证
验证UTX在人类CD8+ T细胞中的保守功能。
利用CRISPR/Cas9在人T1D患者CD8+ T细胞中敲低UTX或STAT3，检测TSCM和TTE细胞频率；并使用TWS119处理细胞以诱导TCF1表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Dynabeads小鼠T细胞激活剂CD3/CD28 | Gibco | -- |
| Dynabeads人T细胞激活剂CD3/CD28 | Gibco | -- | |
| EasySep小鼠CD8+ T细胞分离试剂盒 | STEMCELL Technologies | 19853 | |
| EasySep小鼠CD4+ T细胞分离试剂盒 | STEMCELL Technologies | 19852 | |
| EasySep人CD8+ T细胞分离试剂盒 | STEMCELL Technologies | 17953 | |
| 基因编辑 | Neon NxT电穿孔系统 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| buffer T | Thermo Fisher | -- | |
| 重组NLS-Cas9 | QB3 MacroLab | -- | |
| sgRNA（Synthego） | Synthego | -- | |
| 细胞培养 | TWS119 | -- | -- |
| 细胞因子 | IL-7 | Peprotech | 200-07 |
| IL-15 | Peprotech | 200-15 | |
| IL-2 | -- | -- | |
| 流式细胞术 | NRP-V7/H-2Kd PE四聚体 | NIH Tetramer Core Facility | -- |
| eBioscience Foxp3/转录因子试剂盒 | eBioscience | -- | |
| BD Cytofix/Cytoperm固定/透化试剂盒 | BD Biosciences | 554714 | |
| 组织处理 | IV型胶原酶 | -- | -- |
| 脱氧核糖核酸酶I | -- | -- | |
| 蛋白分析 | 核复合物免疫共沉淀试剂盒 | Active Motifs | -- |
| 抗FLAG M2磁珠 | Millipore | -- | |
| 抗UTX抗体 | Cell Signaling Technology | 33510 | |
| IgG同型对照 | Cell Signaling Technology | 3900S | |
| 蛋白A | Cell Signaling Technology | -- | |
| NuPAGE Bis-Tris微型蛋白凝胶，4-12% | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| HA标签（C29F4）兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 3724 | |
| 抗FLAG M2单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 8146 | |
| 山羊抗兔IgG（H+L）二抗，HRP | Abcam | ab205718 | |
| 抗小鼠IgG，HRP连接抗体 | Cell Signaling Technology | 7076 | |
| IRdye 800CW山羊抗小鼠IgG | LICOR | 926-32210 | |
| 山羊抗兔680LT | LICOR | 926-68021 | |
| 基因表达分析 | Quick RNA小量制备试剂盒 | Zymo | -- |
| TapeStation | Agilent | -- | |
| Novaseq X Plus | Illumina | -- | |
| ATAC-seq | 转座酶（Illumina） | Illumina | -- |
| DNA纯化浓缩试剂盒-5 | Zymo Research | -- | |
| AMPure XP磁珠 | Beckman Coulter | -- | |
| Qubit | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| CUT&Tag | 伴刀豆球蛋白A包被的磁珠 | Polysciences | 86057-3 |
| 抗UTX抗体 | Cell Signaling Technology | 33510 | |
| 豚鼠抗兔IgG | Fisher Scientific | NBP172763 | |
| pAG–Tn5接头复合物 | EpiCypher | -- | |
| NEBNext 2x预混液 | New England Biolabs | -- | |
| KAPA纯SPRI磁珠 | Roche | -- | |
| 细胞培养 | TransIT-293转染试剂 | Mirus | -- |
| 质粒 | Flag-UTX质粒 | Addgene | 17438 |
| HA-TCF1质粒 | Addgene | 40620 | |
| Flag-STAT3质粒 | Addgene | 8709 | |
| HA-UTX质粒 | Addgene | 24168 | |
| 细胞培养 | Ficoll-paque | GE Healthcare | -- |
| RPMI培养基 | Gibco | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型建立 | 小鼠品系、UTXfl/flLck-Cre+基因型、雌性、年龄匹配 阅读提示：Methods: Mice |
| 糖尿病监测 | 尿糖试纸检测频率、阳性标准（连续两次≥250 mg/l） 阅读提示：Methods: Assessment of diabetes |
| 免疫细胞分析 | pLN和胰腺免疫细胞分离方法、抗体克隆和荧光标记、流式细胞仪设置 阅读提示：Methods: Immune cell isolation; Flow cytometry and cell sorting |
| 过继转移实验 | 供体细胞类型、细胞数量、受体小鼠品系（NOD.SCID）、转移途径（静脉注射）、分析时间点 阅读提示：Methods: Adoptive T cell transfer |
| 单细胞RNA测序 | 样本处理、文库构建、测序平台、生物信息学分析流程（Seurat版本、聚类参数） 阅读提示：Methods: Single-cell RNA analysis |
| ATAC-seq | 细胞数量（50,000）、转座酶用量、PCR循环数、测序平台、分析参数（ |log2 fold change| >0.5, FDR<0.05） 阅读提示：Methods: ATAC-seq library construction and data processing |
| CUT&Tag | 细胞数量（300,000）、抗体稀释度、pAG-Tn5浓度、PCR循环数、分析参数 阅读提示：Methods: CUT&Tag library preparation and data processing |
| 人CD8+ T细胞编辑 | PBMC分离、CD8+ T细胞分离、CRISPR/Cas9电转条件（电压、脉冲）、细胞因子浓度和培养时间 阅读提示：Methods: Isolation of human CD8+ T cells; Genome editing in human resting CD8+ T cells by CRISPR |
| 共免疫沉淀 | 细胞类型（HEK-293T或Jurkat）、转染质粒、裂解液体积、抗体量、洗涤次数 阅读提示：Methods: Coimmunoprecipitation and Western blot |