鼻洗液抗病毒活性筛查
检测人鼻洗液是否抑制SARS-CoV-2假病毒感染，并比较不同年龄组差异
收集健康志愿者的鼻洗液，超滤浓缩后与假病毒预孵育，感染293T/ACE2细胞测定感染性。
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SARS-CoV-2 Delta和Omicron变异株抵抗人气道胰蛋白酶样蛋白酶对刺突蛋白的切割
SARS-CoV-2 Delta and Omicron variants resist spike cleavage by human airway trypsin-like protease
实验完整度
高包含体外假病毒和活病毒实验、细胞-细胞融合实验、分子切割与质谱鉴定、分子动力学模拟、小鼠体内攻毒模型及非人灵长类样本验证，证据层级多且含功能与机制验证。
主要模型
293T/ACE2细胞 Calu-3细胞 Vero E6细胞 hACE2转基因小鼠模型
重点核对
鼻洗液样本来源：20名健康志愿者，分年轻组（20-30岁）和老年组（55-70岁） 假病毒预孵育条件：HAT浓度0.5-5 μg/mL，37°C孵育2小时 活病毒实验：MOI=0.05，HAT预孵育2小时 体内攻毒模型：5×10^4 PFU病毒与80 ng HAT预孵育，经鼻内接种hACE2小鼠 关键突变：Delta P681R和Omicron P681H对HAT抗性的影响
摘要
上呼吸道中的可溶性宿主因子可作为抵御SARS-CoV-2感染的第一道防线。在本研究中，我们描述了一种人气道胰蛋白酶样蛋白酶（HAT）的鉴定及其功能，该蛋白酶能够降低祖先型SARS-CoV-2的感染性。此外，在小鼠模型中，SARS-CoV-2感染可上调HAT类似物的表达。HAT的抗病毒活性通过切割SARS-CoV-2刺突蛋白的R682位点实现。这种切割抑制了祖先型刺突蛋白与宿主细胞的附着，从而抑制了细胞-细胞膜融合过程。重要的是，外源性添加HAT在体内显著降低了祖先型SARS-CoV-2的感染性。然而，HAT对Delta变异株和大多数流行的Omicron变异株（包括BQ.1.1和XBB.1.5亚变异株）无效。我们证明，Delta变异株的P681R突变和Omicron变异株的P681H突变（位于R682切割位点附近）导致了HAT抗性。我们的研究报告了一种我们认为新型的可溶性防御因子对抗SARS-CoV-2的作用，以及Delta和Omicron变异株对其作用的抵抗。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 人气道胰蛋白酶样蛋白酶（HAT）是否具有抗SARS-CoV-2活性，以及SARS-CoV-2变异株是否对其产生抵抗？
- 核心机制
- HAT通过切割刺突蛋白R682位点，破坏刺突蛋白与ACE2受体的结合并抑制细胞-细胞膜融合，从而抑制病毒感染。Delta和Omicron变异株的P681R/H突变降低了HAT的切割效率，导致抗性。
- 主要证据
- 假病毒和活病毒感染实验显示HAT降低祖先型病毒感染性；质谱鉴定切割位点为R682；分子动力学模拟显示变异株切割位点与HAT结合稳定性降低；小鼠体内实验证实HAT保护作用，而变异株不受影响。
- 研究意义
- 发现HAT作为上呼吸道可溶性防御因子抵抗SARS-CoV-2，变异株的突变使其抵抗HAT作用，可能部分解释其增强的感染性，为理解病毒进化与宿主防御的相互作用提供新视角。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
HAT抗病毒活性验证
验证重组HAT对SARS-CoV-2假病毒和活病毒的抑制作用
重组HAT与假病毒或活病毒预孵育，感染293T/ACE2或Vero E6细胞，检测感染性和病毒RNA水平。
HAT对刺突蛋白结合和膜融合的影响
探究HAT是否通过阻断刺突蛋白与ACE2结合及膜融合来抑制感染
流式细胞术检测HAT预处理的刺突蛋白与293T/ACE2细胞的结合；细胞-细胞融合实验检测合胞体形成。
HAT切割刺突蛋白的鉴定
确定HAT切割刺突蛋白的位点及切割效率
重组刺突蛋白与HAT孵育后SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色；Western blot验证S1/S2片段；质谱鉴定切割位点；测定切割率。
变异株抗性机制研究
探究Delta和Omicron变异株对HAT抗性的分子机制
分子动力学模拟HAT与S1/S2切割位点的相互作用；构建突变假病毒验证P681R和P681H突变的作用。
体内抗病毒效果评估
验证HAT在体内对祖先型和变异株的保护作用
hACE2转基因小鼠经鼻内接种预孵育HAT或PBS的活病毒，检测病理变化和病毒载量。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | PAN-Biotech | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| 鼻洗液浓缩 | 超滤管 | Millipore | -- |
| 假病毒感染 | 重组HAT | R&D Systems | 2695-SE |
| 流式分析 | 生物素标记的刺突蛋白 | Sino Biological | -- |
| PE抗生物素抗体 | Biolegend | 409004 | |
| 细胞融合 | Hoechst 33342染料 | Beyotime Biotechnology | -- |
| Western blot | 抗SARS-CoV-2 S1抗体 | Sino Biological | 40591-T62 |
| 抗SARS-CoV-2 S2抗体 | Sino Biological | 40590-T62 | |
| 抗SARS-CoV-2 N抗体 | Sino Biological | 40143-R001 | |
| HRP标记的抗兔抗体 | Thermo Fisher Scientific | 31460 | |
| Fastblue染色液 | Biosharp | -- | |
| 质谱分析 | C18色谱柱 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| EASY NanoLC 1200液相色谱系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Q Exactive四极杆-轨道阱质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 小鼠实验 | AAV-5载体 | Shanghai Genechem Co., Ltd | -- |
| 免疫荧光 | 抗SARS-CoV-2刺突蛋白RBD抗体 | Sino Biological | 40150-D001 |
| 抗HAT抗体 | Abcam | ab127031 | |
| FITC标记的山羊抗人IgG | Proteintech | SA00003-12 | |
| Alexa Fluor 647标记的山羊抗兔IgG | Cell Signaling Technology | 4414S | |
| 显微镜 | 奥林巴斯FV3000显微镜 | OLYMPUS | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 鼻洗液收集与处理 | 志愿者纳入标准：健康成人，无既往确诊COVID-19；年龄分层：年轻组20-30岁（5男5女），老年组55-70岁（3男7女）；收集方法：20 mL生理盐水冲洗鼻腔，重力收集；浓缩：15 mL样品用超滤管（>10 kDa）4°C 2630g离心30分钟，最终体积400 μL。 阅读提示：Methods: Collection of nasal wash samples; Results: 第一段 |
| 假病毒感染实验 | 假病毒构建：购买自Genomeditech，含荧光素酶报告基因；HAT浓度：0.5-5 μg/mL；预孵育条件：37°C 2小时；细胞接种密度未明确说明。 阅读提示：Methods: Infection by SARS-CoV-2 pseudoviruses or live viruses; Figure 1 legends |
| 活病毒感染实验 | 病毒株：祖先型、Delta、Omicron BA.1；MOI=0.05；HAT预孵育：37°C 2小时；细胞：Vero E6和Calu-3；检测时间：感染后48小时。 阅读提示：Methods: Infection by SARS-CoV-2 pseudoviruses or live viruses; Figure 1 and 2 legends |
| HAT切割刺突蛋白实验 | 重组刺突蛋白来源：ACRO Biosystems；刺突蛋白用量2.5 μg；HAT浓度：0.5-5 μg/mL；孵育条件：37°C 2小时；检测方法：SDS-PAGE、考马斯亮蓝染色、Western blot；切割位点鉴定：质谱分析。 阅读提示：Methods: Coomassie staining and Western blot; Results section 4 |
| 体内攻毒实验 | 小鼠品系：hACE2-KI/NIFDC（C57BL/6J背景），雌性，6-8周龄；病毒量：5×10^4 PFU；HAT用量：80 ng；预孵育：37°C 3小时；接种方式：鼻内滴注；取材时间：感染后第3天。 阅读提示：Methods: Mice and experimental protocol; Figure 4 legends |
| 分子动力学模拟 | HAT结构：AlphaFold预测（UniProt ID O60235），使用催化域（187-418）；S1/S2切割位点序列：T676-A688；力场：CHARMM36；模拟时长：1微秒；温度：300 K；压力：1 bar。 阅读提示：Methods: Molecular modeling of HAT and SARS-CoV-2 S protein S1/S2 cleavage site |