鉴定ITA的GPCR受体
筛选能够被ITA激活的GPCR受体
在HEK293细胞中共转染GPCR、Gα16和水母发光蛋白质粒，通过水母发光蛋白实验检测ITA诱导的钙动员，筛选了301个人GPCR。
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免疫代谢物衣康酸刺激OXGR1促进肺固有免疫反应过程中的黏液纤毛清除
The immunometabolite itaconate stimulates OXGR1 to promote mucociliary clearance during the pulmonary innate immune response
实验完整度
高实验包含GPCR筛选、体外细胞信号通路验证、突变体功能实验、动物感染模型及原代细胞和人体细胞实验，多层次证据支持结论。
主要模型
HEK293细胞（过表达OXGR1） 骨髓来源巨噬细胞（BMDMs） 小鼠原代气管上皮细胞 小鼠肺部感染模型（铜绿假单胞菌PAO1）
重点核对
ITA浓度：0.3 mM（EC50） GPCR筛选：301个人GPCR 小鼠感染模型：PAO1菌株，1×10^7 CFU ITA补充剂量：1 mM 检测时间：感染后12小时
摘要
病原体和炎症条件快速诱导髓系细胞中免疫应答基因1（IRG1）的表达。IRG1编码乌头酸脱羧酶（ACOD1），该酶产生免疫调节代谢物衣康酸（ITA）。除了快速的细胞内积累，ITA也被分泌到细胞外，但分泌的ITA是否作为信号分子尚不清楚。在此，我们确定ITA是GPCR OXGR1的正构激动剂，其EC50约为0.3 mM，与巨噬细胞活化后细胞外ITA的生理浓度范围相同。ITA激活OXGR1诱导Ca2+动员、ERK磷酸化和受体内吞。在铜绿假单胞菌肺部感染的小鼠模型中，ITA刺激Oxgr1依赖的呼吸道上皮黏液分泌和运输，这是气道的主要固有防御机制。因此，我们的研究确定ITA是OXGR1的真正配体，并揭示了肺固有免疫反应中ITA/OXGR1旁分泌信号通路。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 分泌的衣康酸（ITA）是否作为信号分子发挥功能？
- 核心机制
- ITA作为OXGR1的正构激动剂，通过Gq/11和β-arrestin信号通路激活OXGR1，促进呼吸道黏液分泌和运输，增强黏液纤毛清除。
- 主要证据
- GPCR筛选显示OXGR1是唯一响应ITA的受体；突变体实验证实ITA与OXGR1正构位点结合；小鼠感染模型中Oxgr1缺失导致细菌清除受损，ITA补充可挽救Irg1缺失的表型。
- 研究意义
- 揭示ITA/OXGR1旁分泌信号通路在肺固有免疫中的关键作用，并提出OXGR1作为治疗黏液清除缺陷的潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外验证ITA激活OXGR1的信号通路
探究ITA/OXGR1激活后的下游信号通路
在过表达OXGR1的HEK293细胞中，检测ITA刺激后的钙动员、ERK磷酸化、β-arrestin依赖的受体内吞，并通过siRNA敲低Gq/11和β-arrestin验证信号依赖。
突变实验验证ITA与OXGR1正构位点结合
验证ITA通过正构位点激活OXGR1
基于AlphaFold结构预测OXGR1正构位点残基，构建多个点突变体，通过钙动员和受体内吞实验检测突变对ITA响应的影响，并用细胞热位移实验验证结合。
体内检测感染小鼠气道中ITA和α-KG浓度
确定感染条件下气道中ITA和α-KG的浓度是否足以激活OXGR1
构建铜绿假单胞菌PAO1感染的小鼠模型，收集支气管肺泡灌洗液（BAL），用LC-MS检测ITA浓度，用GC-MS检测α-KG浓度，并利用尿素浓度计算上皮衬液中的浓度。
评估ITA对黏液纤毛清除的促进作用
验证ITA/OXGR1信号对呼吸道黏液分泌和运输的影响
使用原代小鼠和人气道上皮细胞，检测ITA刺激后的钙动员；用离体小鼠气管培养和ALI培养系统，测量荧光珠运动评估黏液运输；小鼠鼻内给予ITA后，用阿尔辛蓝/PAS染色检测黏液分泌。
验证ITA/OXGR1在细菌清除中的作用
明确ITA/OXGR1在气道病原体清除中的功能
对WT、Oxgr1 KO和Irg1 KO小鼠进行PAO1感染，检测BAL和肺组织的菌落形成单位（CFU）；部分实验在感染同时补充ITA，观察对细菌清除的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| GPCR筛选 | PRESTO-Tango文库 | Addgene | kit no. 1000000068 |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | EXCELL | -- | |
| PneumaCult-Ex Plus培养基 | STEMCELL Technologies | -- | |
| PneumaCult-ALI培养基 | STEMCELL Technologies | -- | |
| Transwell插入式培养皿 | Corning | 0.4 μm pore size | |
| 巨噬细胞集落刺激因子 | -- | -- | |
| 细胞转染 | PolyJet转染试剂 | SinaGen | -- |
| Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| 钙信号检测 | 腔肠素 | -- | -- |
| Fluo-4AM钙离子荧光探针 | -- | -- | |
| cAMP检测 | GloSensor cAMP检测试剂 | Promega | -- |
| 信号通路抑制 | IBMX（3-异丁基-1-甲基黄嘌呤） | -- | -- |
| Western blot | 抗磷酸化ERK抗体 | Cell Signaling Technology | 4370 |
| 抗FLAG抗体 | Cell Signaling Technology | 14793 | |
| 抗IRG1/ACOD1抗体 | Cell Signaling Technology | 19857 | |
| 抗Myc抗体 | Cell Signaling Technology | 2278 | |
| 抗ERK抗体 | Proteintech | 67170-1-Ig | |
| 抗肌动蛋白抗体 | GenScript | A00702 | |
| 免疫荧光 | FITC标记的驴抗兔抗体 | Invitrogen | -- |
| DAPI核酸染料 | MilliporeSigma | -- | |
| FITC标记的鬼笔环肽 | Invitrogen | -- | |
| 显微镜 | Leica SP8激光共聚焦显微镜 | Leica | -- |
| 细胞成像 | BioTek Cytation 5细胞成像系统 | BioTek | -- |
| 代谢物检测 | Acquity UPLC I-Class超高效液相色谱 | Waters | -- |
| Xevo TQ-XS三重四极杆质谱仪 | Waters | -- | |
| Agilent 7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪 | Agilent | -- | |
| 动物实验 | Oxgr1敲除小鼠 | -- | -- |
| Irg1敲除小鼠 | The Jackson Laboratory | stock no. 029340 | |
| 统计 | GraphPad Prism 8.0 | GraphPad Software | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| GPCR筛选 | 使用301个GPCR质粒，共表达Gα16和aequorin，ITA刺激浓度 阅读提示：参见方法部分“Aequorin assay”和结果部分“A screen of GPCR receptors discovers OXGR1 as an ITA receptor” |
| 细胞信号检测 | ITA浓度（0.5 mM），细胞类型（HEK293或原代上皮细胞），孵育时间 阅读提示：参见方法部分“Aequorin assay, Fluo-4AM assay, and GloSensor assay” |
| 动物感染模型 | 小鼠基因型（WT、Oxgr1 KO、Irg1 KO），PAO1菌株剂量（1×10^7 CFU），感染时间（12小时），ITA补充剂量（1 mM） 阅读提示：参见方法部分“Mouse intranasal infection” |
| 黏液纤毛评估 | 离体气管培养或ALI培养，ITA浓度（500 μM），检测方法（荧光珠运动） 阅读提示：参见方法部分“Measurement of particle transport” |
| 黏液分泌检测 | 小鼠鼻内给药剂量（500 μM ITA），给药后时间（1小时），染色方法（Alcian blue/PAS） 阅读提示：参见方法部分“Histological analysis of nasal cavity” |