血浆蛋白质组学筛选 BACE2 底物
寻找受 BACE2 调控、可作为体内活性标志物的蛋白。
对 WT 和 Bace2 KO 小鼠血浆进行定量蛋白质组学分析，结合 MSD 和免疫印迹验证，鉴定差异蛋白 VEGFR3。
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阿尔茨海默病相关蛋白酶 BACE2 切割 VEGFR3 并调节其信号传导
The Alzheimer's disease-linked protease BACE2 cleaves VEGFR3 and modulates its signaling
实验完整度
高包含血浆蛋白质组学、细胞实验（HEK293、LEC、MIN6）、斑马鱼体内模型及非人灵长类/人类样本验证，并明确进行功能与机制验证。
主要模型
原代人淋巴管内皮细胞 (LEC) HEK293 细胞 斑马鱼胚胎 小鼠模型 (Bace2 KO, BACE 抑制剂处理)
重点核对
BACE2 失活（基因敲除或药物抑制）导致 sVEGFR3 减少、全长 VEGFR3 增加。 BACE2 切割 VEGFR3 的位点位于近膜域。 BACE2 抑制增强 LEC 中 DLL4 和 FOXC2 的表达。 斑马鱼中 Bace2 抑制导致面部淋巴管发育增强。 sVEGFR3 作为 BACE2 药效学标志物，对 BACE2 活性变化敏感且响应快速。
摘要
β-分泌酶 β-位点 APP 切割酶（BACE1）是阿尔茨海默病的一个核心药物靶点。经临床测试的 BACE1 导向抑制剂也会阻断同源蛋白酶 BACE2。然而，关于生理性 BACE2 底物及其在体内的功能，目前知之甚少。在此，我们鉴定出 BACE2 是脱落淋巴管生成性血管内皮生长因子受体 3（VEGFR3）的蛋白酶。BACE2（而非 BACE1）的失活抑制了原代人淋巴管内皮细胞（LEC）中 VEGFR3 的脱落，并减少了小鼠、非人灵长类动物和人类血液中脱落的可溶性 VEGFR3（sVEGFR3）胞外域的释放。在功能上，BACE2 失活增加了全长 VEGFR3，增强了 LEC 中的 VEGFR3 信号传导，并在斑马鱼体内也观察到了 LEC 迁移增强。因此，本研究将 BACE2 鉴定为淋巴管生成性 VEGFR3 信号传导的调节因子，并证明了 sVEGFR3 作为体内 BACE2 活性药效学血浆标志物的实用性，这是开发用于更安全预防阿尔茨海默病的 BACE1 选择性抑制剂的先决条件。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- BACE2 在体内的生理底物是什么？其功能与阿尔茨海默病治疗中 BACE 抑制剂副作用有何关联？
- 核心机制
- BACE2 在近膜域切割 VEGFR3，减少全长受体丰度，从而负向调节 VEGFR3 信号传导；其切割产物 sVEGFR3 可进入血浆，作为 BACE2 活性标志物。
- 主要证据
- 血浆蛋白质组学发现 Bace2 KO 小鼠 sVEGFR3 显著降低；细胞实验证实 BACE2 过表达增加 VEGFR3 脱落，敲低或抑制 BACE2 则相反；斑马鱼体内抑制 Bace2 导致 LEC 迁移增强和面部淋巴管延长。
- 研究意义
- 该研究为理解 BACE2 生理功能及 BACE 抑制剂副作用提供了基础，并确立了 sVEGFR3 作为血浆药效学标志物，有助于开发更安全的 BACE1 选择性抑制剂。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外表征 BACE2 介导的 VEGFR3 切割
验证 BACE2 能否直接切割 VEGFR3，并确定切割产物与位点。
在 HEK293 和 MIN6 细胞中过表达或内源性表达 VEGFR3，通过 Western blot 检测切割产物，并通过 LC-MS/MS 和体外肽段切割实验确定切割位点。
验证内源性 BACE2 在 LEC 中的作用
在生理相关细胞模型中确认 BACE2 对 VEGFR3 脱落和信号传导的调节作用。
使用原代人 LEC，通过 siRNA 敲低或药物抑制 BACE2，检测 sVEGFR3 分泌、全长 VEGFR3 水平及下游信号基因（DLL4, FOXC2）表达。
斑马鱼体内评估 Bace2 对淋巴管生成的影响
在脊椎动物模型体内验证 Bace2 对 VEGFR3 信号及淋巴管发育的功能影响。
斑马鱼胚胎用 verubecestat 处理，通过荧光成像量化面部淋巴管（LFL）长度和内皮细胞数量。
验证 sVEGFR3 作为 BACE2 药效学标志物
评估 sVEGFR3 在体内不同干预条件下的敏感性，并确证其跨物种的保守性。
检测小鼠在急性、亚慢性 BACE 抑制剂处理及不同剂量下的血浆 sVEGFR3；检测非人灵长类（NHP）和临床试验参与者血浆 sVEGFR3，并与传统毛发脱色和 CSF Aβ 进行比较。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白质组学 | Q-Exactive HF 质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| EASY nLC-1000 纳升液相色谱 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 细胞培养 | 人微血管内皮细胞-dlyAd | Lonza | CC-2543 |
| EBM 生长试剂盒 | Lonza | CC-3202 | |
| 药物处理 | verubecestat | BIOZOL | MBS579527 |
| 基因表达分析 | QIAGEN RNA 提取试剂盒 | QIAGEN | 74104 |
| iScript 逆转录混合液 | Bio-Rad | 1708841 | |
| SYBR Green 预混液 | Bio-Rad | 1725270 | |
| StepOnePlus 热循环仪 | Thermo Scientific | -- | |
| 抗体 | VEGF 受体 3 单克隆抗体 AFL4 | Thermo Fisher | 14-5988-82 |
| VEGFR3/Flt-4 生物素化抗体 | R&D Systems | BAF743 | |
| 抗人 VEGFR3 抗体 | Chemicon | MAB3757 | |
| 抗 BACE2 抗体 | Abcam | ab5670 | |
| 抗 BACE1 抗体 | Cell Signaling Technology | 5606S | |
| 动物实验 | verubecestat | -- | -- |
| 化合物 89 | -- | -- | |
| LY2811376 | -- | -- | |
| 斑马鱼实验 | 三卡因 | -- | -- |
| verubecestat | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 血浆蛋白质组学 | Bace2 KO 小鼠品系，血浆体积 1 μL，酶解条件（LysC/trypsin），LC-MS/MS 梯度（120/180 分钟） 阅读提示：Methods: Digestion of nonenriched plasma, LC-MS/MS analysis |
| 细胞培养与处理 | LEC 来源（HMVEC-dlyAd），培养条件（EBM+Growth Kit），细胞密度（200,000/孔），siRNA 浓度（5 μM）及处理时间（48 小时） 阅读提示：Methods: Immunological detection in LECs |
| BACE2 切割位点鉴定 | MIN6 细胞稳定表达 Vegfr3，分泌蛋白免疫沉淀，PNGaseF 去糖基化，LysN 消化，LC-MS/MS 分析 阅读提示：Methods: VEGFR3 purification, Sample preparation, LC-MS/MS |
| 斑马鱼体内实验 | 斑马鱼品系（flt4:mCit, fli:nucGFP, lyve1:dsRed），verubecestat 浓度（100 μM），处理时间（3 天），成像时间点（3 dpf, 5 dpf） 阅读提示：Methods: Imaging of zebrafish facial lymphatics |
| 药物处理 | verubecestat 剂量（小鼠：3 天 50 mg/kg 口服 BID，饮食 0.002%/0.1%；NHP：7 天 10 mg/kg；人类：28 天 50 mg），给药途径，处理时间 阅读提示：Methods: Pharmacodynamic properties of VEGFR3, NHP experiments |