转录组分析鉴定吉非替尼处理后的信号通路变化
鉴定在EGFRT790M耐药的PC9GR细胞中，吉非替尼处理引起的分子变化，特别是对KRAS信号通路的影响。
对PC9GR细胞进行血清饥饿18小时，然后用DMSO或吉非替尼（1 μM）处理6小时，提取RNA进行RNA-Seq，并通过基因集富集分析（GSEA）分析Hallmark基因集。
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Notch抑制克服EGFR驱动的肺腺癌中酪氨酸激酶抑制剂的耐药性
Notch inhibition overcomes resistance to tyrosine kinase inhibitors in EGFR-driven lung adenocarcinoma
实验完整度
高包含转基因小鼠模型、PDX模型、细胞系体外实验、异种移植瘤模型及患者样本分析等多个独立证据层级，并有明确的机制验证（ChIP、siRNA敲低等）。
主要模型
EGFRT790M/L858R转基因小鼠模型 EGFRT790M/L858R患者来源异种移植瘤模型（PDX） PC9GR细胞系（EGFRT790M） PC9GROR细胞系（EGFRC797S）
重点核对
EGFRT790M/L858R小鼠模型经多西环素诱导8周形成肿瘤 DBZ给药剂量为3.3 mg/kg/天，每周4天，腹腔注射 吉非替尼给药剂量为20 mg/kg/天，每周4天，灌胃 奥希替尼给药剂量为5 mg/kg/天，每周5天，灌胃 PC9GR细胞皮下注射量为3.5×10^6个细胞
摘要
接受吉非替尼和奥希替尼治疗的EGFR突变肺腺癌患者，其治疗效果受到继发性突变（如EGFRT790M和EGFRC797S）出现的限制。通常认为这些继发性突变使EGFR对抑制剂完全无反应，但与此相反，我们发现吉非替尼和奥希替尼在EGFRT790M和EGFRC797S肿瘤细胞中增加了STAT3磷酸化（p-STAT3）。有趣的是，我们还发现，伴随Notch抑制的吉非替尼或奥希替尼治疗诱导了p-STAT3依赖的转录抑制因子HES1水平的强烈降低。重要的是，我们证明了具有EGFRT790M和EGFRC797S突变的酪氨酸激酶抑制剂耐药肿瘤，分别对Notch抑制剂与吉非替尼或奥希替尼的联合治疗高度敏感。最后，在接受酪氨酸激酶抑制剂治疗的EGFR突变患者中，HES1蛋白水平在复发期间增加，并与较短的无进展生存期相关。因此，我们的结果为肺腺癌奥希替尼治疗患者在疾病进展后提供了一种化疗替代治疗方案的概念验证。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Notch信号通路是否在EGFR驱动的肺腺癌对酪氨酸激酶抑制剂（TKI）耐药中发挥作用，以及抑制Notch能否克服这种耐药性。
- 核心机制
- TKI（吉非替尼或奥希替尼）处理增加p-STAT3水平，当同时抑制Notch时，p-STAT3直接结合到HES1启动子并抑制其表达，从而降低HES1蛋白水平。
- 主要证据
- 在EGFRT790M/L858R转基因小鼠、PDX模型及PC9GR细胞中，DBZ与吉非替尼联合治疗显著抑制肿瘤生长并降低HES1表达；ChIP实验证明p-STAT3在联合治疗时结合HES1启动子；siSTAT3敲低逆转了HES1的下调。
- 研究意义
- 研究表明Notch抑制与TKI联合是一种克服EGFR门控突变耐药的有效策略，为奥希替尼治疗后进展的肺腺癌患者提供了化疗之外的替代治疗方案，并支持开展相关临床试验。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估Notch信号通路在EGFRT790M/L858R驱动的肺肿瘤中的激活状态
检测在EGFRT790M/L858R驱动的肺肿瘤中Notch通路是否被激活，并比较NOTCH1、NOTCH3和NOTCH2的表达水平。
将EGFRT790M/L858R小鼠与CCSP-rtTA转基因小鼠杂交，用多西环素诱导8周形成肺肿瘤。通过Western blot分析肿瘤和正常肺组织中N1ICD、HES1、NOTCH1、NOTCH2和NOTCH3的蛋白表达。
验证Notch抑制对EGFRT790M/L858R驱动肿瘤生长的影响
确定Notch信号通路是否是EGFRT790M/L858R驱动肿瘤生长所必需的。
将荷瘤EGFRT790M/L858R小鼠随机分为三组：对照（甲基纤维素和IgG）、γ-分泌酶抑制剂DBZ、抗NOTCH1和NOTCH3抗体（NRR1/NRR3），治疗5周后分析肿瘤面积、HES1、Ki67、p-ERK和p-AKT的表达。
评估Notch抑制联合吉非替尼对EGFRT790M/L858R驱动的肿瘤耐药性的影响
研究Notch抑制能否克服EGFRT790M门控突变赋予的吉非替尼耐药性。
将荷瘤EGFRT790M/L858R小鼠随机分为四组：对照、吉非替尼、DBZ、吉非替尼+DBZ，治疗5周后分析肿瘤面积、肺腺癌数量以及HES1、Ki67、p-ERK和p-AKT的表达。
在PDX模型中验证Notch抑制联合吉非替尼的疗效
在更接近临床的PDX模型中验证Notch抑制联合吉非替尼能否克服EGFRT790M/L858R突变介导的耐药性。
将携带EGFRT790M/L858R突变的人肺腺癌PDX组织块（0.5 mm³）皮下植入裸小鼠，一周后随机分为四组：对照、吉非替尼、DBZ、吉非替尼+DBZ，治疗30天并监测肿瘤生长，随后进行IHC分析。
分析联合治疗对HES1表达的协同效应及EGFR依赖性
验证吉非替尼与Notch抑制联合治疗对HES1表达的协同下调作用，并确定该效应是否依赖EGFR。
在PC9GR细胞中，用DMSO、DBZ、吉非替尼或DBZ+吉非替尼处理，通过Western blot检测HES1表达。在CHO细胞（EGFR天然缺失）中，转染空载体或pEGFRT790M/L858R后进行相同处理，检测HES1表达。通过siRNA敲低HES1观察对细胞增殖和吉非替尼敏感性的影响。
阐述p-STAT3直接结合HES1启动子并抑制其表达的机制
阐明在联合治疗条件下，p-STAT3如何抑制HES1表达。
在PC9GR细胞中，通过Western blot检测p-STAT3水平。通过ChIP实验检测NOTCH1和p-STAT3与HES1启动子的结合。通过siRNA敲低STAT3，检测联合治疗对HES1表达的影响。
验证Notch抑制联合奥希替尼对EGFRC797S突变细胞的疗效
确定Notch抑制联合奥希替尼能否克服EGFRC797S突变介导的奥希替尼耐药性。
在PC9GROR细胞中，用DMSO、DBZ、奥希替尼或DBZ+奥希替尼处理，Western blot检测p-STAT3和HES1表达。将PC9GROR细胞皮下植入裸鼠，2周后随机分为四组：对照、DBZ、奥希替尼、DBZ+奥希替尼，治疗3周，监测肿瘤生长。
评估尼罗卡斯特（Nirogacestat）联合吉非替尼的治疗效果
评估临床在研γ-分泌酶抑制剂尼罗卡斯特联合吉非替尼能否克服EGFRT790M介导的耐药性，并考察其生存获益。
将PC9GR细胞皮下植入裸鼠，随机分为六组：对照、DBZ、尼罗卡斯特、吉非替尼、DBZ+吉非替尼、尼罗卡斯特+吉非替尼，监测肿瘤生长。另外进行生存分析实验，比较对照组、尼罗卡斯特、吉非替尼、尼罗卡斯特+吉非替尼的生存期。
分析患者样本中HES1表达与临床预后的相关性
验证HES1表达水平与EGFR突变肺腺癌患者接受TKI治疗的预后之间的关系。
对75例接受TKI治疗的EGFR突变肺腺癌患者的肿瘤样本进行HES1免疫组化染色，分析核HES1表达水平与无进展生存期（PFS）的关系。另外，分析7例患者在诊断时和疾病进展后的配对样本中HES1核表达水平的变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物模型 | 裸鼠（Nude-Foxn1） | Envigo | -- |
| 药物处理 | 二苯并氮杂卓（DBZ） | Syncom | -- |
| 尼罗卡斯特 | MedChemExpress | -- | |
| 吉非替尼 | CliniSciences | -- | |
| 奥希替尼 | CliniSciences | -- | |
| PD173074 | CliniSciences | -- | |
| 鲁索利替尼 | CliniSciences | -- | |
| 动物实验（抗体处理） | NRR1抗体 | Genentech | -- |
| NRR3抗体 | Genentech | -- | |
| Western blot | N1ICD抗体 | Cell Signaling Technology | 4147 |
| HES1抗体 | Cell Signaling Technology | 11988 | |
| NOTCH1抗体 | Cell Signaling Technology | 3608 | |
| NOTCH2抗体 | Cell Signaling Technology | 5732 | |
| NOTCH3抗体 | Cell Signaling Technology | 5276 | |
| p-STAT3抗体 | Cell Signaling Technology | 9145 | |
| STAT3抗体 | BD | 610189 | |
| 微管蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | T9026 | |
| IHC | HES1抗体 | Cell Signaling Technology | 11988 |
| Ki67抗体 | Agilent | TEC-3 | |
| p-ERK抗体 | Cell Signaling Technology | 9101 | |
| p-AKT抗体 | Novus Biologicals | EP2109Y | |
| 细胞培养与转染 | Dharmafect1转染试剂 | -- | -- |
| 细胞增殖实验 | 磺基罗丹明B | -- | -- |
| ChIP | ChIP-Adem试剂盒 | Ademtech | -- |
| ChIP DNA Prep Adem试剂盒 | Ademtech | -- | |
| AutoMag机器人 | -- | -- | |
| 抗NOTCH1抗体 | Abcam | ab27525 | |
| 抗磷酸化STAT3抗体 | Cell Signaling Technology | 9145 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体内EGFRT790M/L858R模型 | 多西环素诱导时长（8周）、基因型（EGFRT790M/L858R;CCSP-rtTA）、治疗分组、药物剂量与给药方式（DBZ 3.3 mg/kg i.p.、吉非替尼20 mg/kg p.o.）、治疗时间（5周） 阅读提示：Methods - Mice; Results - Figure 1C, 2A |
| PDX模型 | PDX组织来源（TNM分期）、植入组织块大小（0.5 mm³）、植入部位与动物品系（雌性裸鼠，右侧flank）、治疗开始时间（植入后1周）、药物剂量与给药方式、治疗时长（30天） 阅读提示：Methods - PDX model; Results - Figure 3A |
| 细胞系体外实验 | 细胞系（PC9GR、PC9GROR）、细胞密度、饥饿处理时长（18小时）、药物浓度（吉非替尼1 μM、DBZ 250 nM、奥希替尼250 nM）、处理时长（6小时等） 阅读提示：Methods - Cell culture and transfection reagents; Results - Figure 1A, 4C, 5A, 6A |
| siRNA敲低实验 | siRNA类型（siNT、siHES1、siSTAT3）、转染浓度（20 nM）、转染试剂（Dharmafect1）、处理时间（72小时） 阅读提示：Methods - Cell culture and transfection reagents; Results - Figure 4D, 5C |
| 患者样本分析 | 患者数量（75例）、HES1 IHC评分标准（0-5）、分组阈值（低：0-2.50，高：2.51-5.00）、配对样本数量（7例）、统计方法 阅读提示：Methods - Patients; Results - Figure 7, C and D |