分离并鉴定侵袭性与非侵袭性肺成纤维细胞
通过Matrigel侵袭实验区分具有不同侵袭能力的成纤维细胞，并用于后续分析。
将从正常和IPF肺分离的成纤维细胞接种于Matrigel侵袭小室，以PDGF-BB作为趋化因子，培养24小时后收集侵袭性和非侵袭性细胞，用于scRNA-seq和体外功能实验。
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HER2通过激活侵袭性肺成纤维细胞中的转移性癌症特征驱动肺纤维化
HER2 drives lung fibrosis by activating a metastatic cancer signature in invasive lung fibroblasts
实验完整度
高包含scRNA-seq、bulk RNA-seq、体外迁移侵袭实验、siRNA敲低、HER2过表达与敲低、人源化SCID小鼠模型和博来霉素小鼠模型，并进行功能与机制验证。
主要模型
人肺成纤维细胞（正常与IPF） SEMA7A高/低表达的IPF肺成纤维细胞 人源化SCID IPF小鼠模型（NSG小鼠） 博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型（C57BL/6J小鼠）
重点核对
侵袭性与非侵袭性成纤维细胞的分离通过Matrigel侵袭实验区分 HER2信号通路作为关键上游调节因子的验证依赖于IPA分析和Western blot检测p-HER2水平 HER2过表达或敲低对成纤维细胞侵袭和肺纤维化的影响通过体外侵袭实验和人源化SCID小鼠模型评估 Lapatinib和Pertuzumab处理对IPF成纤维细胞侵袭和纤维化的抑制作用
摘要
进行性组织纤维化，包括特发性肺纤维化（IPF），其特征在于成纤维细胞过度募集到组织损伤部位和持续的细胞外基质沉积，并与严重的发病率和死亡率相关。然而，控制进行性IPF的分子机制尚未完全确定。先前的研究表明，侵袭性成纤维细胞驱动IPF的疾病进展。在此，我们报告了对来自IPF患者和健康供体的侵袭性和非侵袭性成纤维细胞的图谱分析。通路分析显示，侵袭性成纤维细胞的活化特征（其中最重要的是ERBB2（HER2））与转移性肺腺癌细胞的活化特征高度相似。在正常肺成纤维细胞中激活HER2导致更具侵袭性的遗传程序，并加重成纤维细胞侵袭和肺纤维化，而拮抗HER2信号则减弱成纤维细胞侵袭并改善肺纤维化。这些发现表明，HER2信号可能是成纤维细胞侵袭的关键驱动因素，并可作为IPF治疗干预的有吸引力的靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 侵袭性IPF肺成纤维细胞是否与转移性癌细胞共享类似的分子程序，以及HER2信号是否驱动成纤维细胞侵袭和进行性肺纤维化？
- 核心机制
- HER2信号激活了侵袭性肺成纤维细胞中的转移性肺癌相关基因程序，驱动成纤维细胞侵袭和肺纤维化。
- 主要证据
- scRNA-seq和IPA分析鉴定HER2为侵袭性成纤维细胞中最显著激活的上游调节因子；在正常成纤维细胞中过表达HER2增强侵袭和纤维化，而敲低或抑制HER2（Lapatinib/Pertuzumab）则减弱侵袭和纤维化；在人和小鼠纤维化肺组织中观察到p-HER2升高。
- 研究意义
- HER2信号可能是IPF中成纤维细胞侵袭的关键驱动因素，并作为治疗干预的潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
进行scRNA-seq和转录组分析
获得侵袭性与非侵袭性成纤维细胞的转录组差异，并鉴定关键基因、表面标志物和转录因子。
使用10x Genomics平台对分离的侵袭性和非侵袭性成纤维细胞进行scRNA-seq，结合已发表的bulk RNA-seq数据，分析差异表达基因和上游调节因子。
验证侵袭性成纤维细胞的表面标志物和转录因子
确认候选标志物和转录因子在侵袭性和非侵袭性成纤维细胞中的差异表达及其功能相关性。
通过qRT-PCR、Western blot和流式细胞术验证SEMA7A、F3、ITGA6等表面标志物及FOXF1、HMGA2等转录因子的表达，并通过siRNA敲低实验评估其功能。
评估HER2信号在侵袭性成纤维细胞中的活化
确定HER2信号是否在侵袭性成纤维细胞和纤维化肺组织中激活。
通过Western blot检测SEMA7A高表达和低表达的IPF成纤维细胞中p-HER2和总HER2水平，并在人和小鼠纤维化肺组织中进行验证。
通过过表达和敲低研究HER2的功能
确定HER2激活或抑制对成纤维细胞侵袭和纤维化的影响。
在正常肺成纤维细胞中过表达HER2，在IPF成纤维细胞中敲低HER2或用Lapatinib处理，检测侵袭能力、基因表达和体内纤维化。
在人源化小鼠模型中靶向HER2验证治疗效果
评估药理学抑制HER2是否减轻成纤维细胞诱导的肺纤维化。
将SEMA7A高表达的IPF成纤维细胞注入NSG小鼠，用Lapatinib或Perjeta处理，评估肺纤维化程度和羟脯氨酸含量。同时用博来霉素诱导的纤维化模型验证。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 抗生素-抗真菌剂 | -- | -- | |
| 细胞迁移与侵袭 | BioCoat Matrigel侵袭小室 | -- | -- |
| 血小板衍生生长因子-BB | Peprotech | -- | |
| 染色 | Protocol Hema 3染色套装 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 单细胞测序 | 10x Genomics Chromium平台 | 10x Genomics | -- |
| 基因敲低 | Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| si-FOXF1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-60655 | |
| si-CREBRF | Santa Cruz Biotechnology | sc-91839 | |
| si-TSC22D1 | Thermo Fisher Scientific | 16708 | |
| si-MXI1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-35835 | |
| si-KLF9 | Santa Cruz Biotechnology | sc-37716 | |
| si-NFE2L2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-37030 | |
| si-HMGA2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-37994 | |
| si-DPF3 | Santa Cruz Biotechnology | sc-92150 | |
| ERBB2敲低慢病毒 | GeneCopoeia | LPPHCP267177L03-3-100 | |
| 基因过表达 | HER2过表达慢病毒 | VectorBuilder | -- |
| RNA提取 | RNeasy Mini试剂盒 | Qiagen | -- |
| cDNA合成 | M-MLV逆转录酶 | Promega | -- |
| 流式细胞术 | 抗SEMA7A-PE | BD Biosciences | -- |
| 抗SEMA7A-BV480 | BD Biosciences | -- | |
| 抗CD274-PE | Biolegend | -- | |
| 抗F3-PE | BD Biosciences | -- | |
| 抗ITGA6-PE | BD Biosciences | -- | |
| APC抗CD340 (erbB2/HER2) | Biosciences | -- | |
| FITC抗人CD326 (EpCAM) | Biosciences | -- | |
| PE/Cy7抗人CD31 | Biosciences | -- | |
| PE/Cy7抗人CD45 | Biosciences | -- | |
| DAPI | -- | -- | |
| Western blot | 抗GAPDH | Cell Signaling Technology | -- |
| 抗SEMA7A | Novus Biologicals | NBP1-86555 | |
| 抗F3 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 抗ITGA6 | Cell Signaling Technology | 3750S | |
| 抗FOXF1 | R&D system | AF4798 | |
| 抗CREBRF | Abcam | ab26262 | |
| 抗TSC22D1 | Novus Biologicals | NBP2-46238 | |
| 抗MXI1 | ABclonal | A12098 | |
| 抗KLF9 | Santa Cruz Biotechnology | -- | |
| 抗NFE2L2 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 抗HMGA2 | Cell Signaling Technology | 8179s | |
| 抗DPF3 | Novus Biologicals | NBP2-14910 | |
| 抗p-HER2 | Cell Signaling Technology | 6942s | |
| 抗HER2 | Cell Signaling Technology | 2165s | |
| 抗兔IgG，HRP连接抗体 | Cell Signaling Technology | 7074s | |
| 抗小鼠IgG，HRP连接抗体 | Cell Signaling Technology | 7076s | |
| 过氧化物酶标记驴抗山羊IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 705-036-147 | |
| 免疫荧光 | Cy3标记二抗 | -- | -- |
| FITC标记α-SMA抗体 | Abcam | ab8211 | |
| 细胞活性 | Calcein AM细胞活性检测试剂盒 | R&D systems | 4892-010-K |
| 动物实验 | NSG小鼠 | The Jackson Laboratory | -- |
| C57BL/6J小鼠 | -- | -- | |
| 药物处理 | 拉帕替尼 | Tocris Bioscience | -- |
| 帕妥珠单抗 | Genentech | -- | |
| IgG1同型对照 | Bio X Cell | -- | |
| 动物实验 | 博来霉素 | Hospira | -- |
| 切片 | OCT包埋剂 | -- | -- |
| Superfrost Plus显微镜载玻片 | -- | -- | |
| 细胞生长监测 | IncuCyte ZOOM活细胞分析系统 | Essen BioScience | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 侵袭性成纤维细胞分离 | 细胞来源（正常或IPF）、Matrigel侵袭小室规格、趋化因子浓度（PDGF-BB 10 ng/ml）、培养时间（24小时） 阅读提示：Materials and methods: Human lung fibroblast culture and cell migration and invasion assays |
| scRNA-seq分析 | 样本量（4正常/4IPF）、10x Genomics平台、数据处理软件版本（Cell Ranger 1.3.1, Seurat 4.1.0）、差异表达阈值 阅读提示：Materials and methods: scRNA-seq, data processing, and IPA; Figure S1 |
| HER2功能实验 | 过表达或敲低方法（慢病毒或siRNA）、病毒载体来源、处理时间、检测指标（迁移、侵袭、蛋白表达） 阅读提示：Materials and methods: Gene knockdown assay and qRT-PCR; Western blot; Results and Figure legends for Figures 6 and 7 |
| 人源化SCID IPF模型 | 小鼠品系（NSG）、年龄和性别（6-8周雌性）、细胞注射数量（0.5×10^6细胞/小鼠）和途径（尾静脉）、治疗药物剂量和周期（Lapatinib 50 mg/kg隔天，Pertuzumab 100 μg每周两次，从第35至63天）、检测时间点（第63天） 阅读提示：Materials and methods: Humanized SCID mouse model of IPF; Figure 8 legend |
| 博来霉素模型 | 博来霉素剂量（1.25 U/kg）、给药途径（气管内）、治疗时间（第7至20天）、Lapatinib剂量（50 mg/kg灌胃隔天）、检测时间点（第21天） 阅读提示：Materials and methods: Bleomycin instillation; Figure S5 |