评估前列腺活检组织中的DHEA代谢
探究前列腺组织中DHEA的利用能力及其与肿瘤侵袭性的关联
从患者获取新鲜前列腺活检组织，离体培养并用[3H]-DHEA处理，通过HPLC分析代谢产物，计算3βHSD1活性。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
前列腺中DHEA的活跃摄取与侵袭性前列腺癌相关
Active DHEA uptake in the prostate gland correlates with aggressive prostate cancer
实验完整度
高包含患者样本代谢分析、组学测序、体外细胞实验、体内异种移植模型及药物筛选等多层级验证。
主要模型
患者前列腺活检组织 LNCaP细胞 C4-2细胞 VCaP细胞
重点核对
前列腺活检组织离体培养并使用[3H]-DHEA处理评估DHEA利用能力 LNCaP和VCaP细胞中UBE3D敲低或过表达后检测3βHSD1蛋白水平和DHEA代谢 C4-2细胞异种移植模型评估equilin对肿瘤生长的抑制作用 使用AlphaFold2预测3βHSD1结构进行虚拟筛选
摘要
改善前列腺癌患者的临床获益需要患者分层和早期干预的策略。在这里，我们发现前列腺中活跃的DHEA利用与早期疾病阶段的肿瘤侵袭性相关，并且3βHSD1抑制剂有望用于早期干预。在离体新鲜前列腺活检组织中追踪了[3H]标记的DHEA消耗。活跃的DHEA利用在转移性疾病或治疗抵抗性疾病患者中更常见。分析了与前列腺DHEA利用能力相关的遗传和转录组特征，以生成临床可及的患者分层方法。通过调节3βHSD1稳态，发现UBE3D是患者代谢异质性的调节因子。Equilin作为一种有效的3βHSD1拮抗剂，抑制了DHEA利用并抑制了肿瘤生长，为侵袭性前列腺癌的早期治疗提供了一种有前景的策略。总之，我们的发现表明，前列腺DHEA利用活跃的患者可能从3βHSD1抑制剂作为早期干预中获益。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 前列腺中DHEA的利用能力是否与肿瘤侵袭性相关，以及其潜在的分子机制和治疗策略是什么？
- 核心机制
- UBE3D通过泛素化降解3βHSD1，调节3βHSD1稳态，从而影响DHEA利用和肿瘤侵袭性。
- 主要证据
- 患者活检组织中DHEA利用能力与肿瘤分期和ADT应答相关；UBE3D与3βHSD1相互作用并介导其泛素化；equilin在体外和体内抑制3βHSD1活性和肿瘤生长。
- 研究意义
- DHEA利用特征可用于患者分层，equilin作为3βHSD1抑制剂可能用于早期干预侵袭性前列腺癌。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
进行全外显子组和转录组测序
识别与DHEA利用相关的遗传和转录组特征
选取3βHSD1活性前10%和后10%的活检样本，提取DNA和RNA进行全外显子组和转录组测序。
关联分析遗传变异与DHEA代谢特征
验证GWAS和转录组特征与前列腺癌风险的关联
将识别出的SNP与UKBB和GWAS目录交叉，构建DHEA GWAS特征，并在CPGEA和TCGA中验证。
验证UBE3D对3βHSD1的调控
阐明UBE3D调控3βHSD1稳态的分子机制
通过IP-MS筛选3βHSD1相互作用蛋白，发现UBE3D；通过co-IP、泛素化实验验证UBE3D介导3βHSD1的泛素化和降解。
评估UBE3D对肿瘤细胞功能的影响
验证UBE3D对DHEA利用和细胞增殖的影响
在LNCaP和VCaP细胞中敲低或过表达UBE3D，检测DHEA利用、AR靶基因表达和细胞增殖。
进行体内异种移植实验
验证UBE3D和equilin对肿瘤生长的影响
将UBE3D敲除或过表达的C4-2细胞植入去势小鼠，给予DHEA缓释片和equilin治疗，测量肿瘤体积和重量。
筛选3βHSD1抑制剂
发现抑制DHEA利用的潜在药物
使用虚拟筛选和生化筛选平台筛选3βHSD1抑制剂，并用细胞和动物模型验证equilin的抑制作用。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Invitrogen | -- |
| DMEM培养基 | Invitrogen | -- | |
| 胎牛血清 | ExCell Bio | -- | |
| 类固醇代谢分析 | [3H]标记的脱氢表雄酮 | PerkinElmer | -- |
| β-葡萄糖醛酸酶 | Novoprotein Scientific Inc. | -- | |
| Acquity Arc系统 | Waters | -- | |
| β-RAM 5型放射检测器 | LabLogic Systems | -- | |
| RNA-seq | AllPrep DNA/RNA/蛋白小提试剂盒 | QIAGEN | -- |
| VAHTS mRNA-seq V3文库制备试剂盒 | Vazyme | NR611 | |
| NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- | |
| Qubit荧光计 | Invitrogen | -- | |
| QIAxcel先进系统 | QIAGEN | -- | |
| 全外显子组测序 | Agilent SureSelect人全外显子v6 | Agilent Technologies | -- |
| HiSeq X-10测序仪 | Illumina | -- | |
| Nanodrop分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 分子克隆 | pMAL-C2X-3C载体 | New England Biolabs | -- |
| 蛋白纯化 | MBP树脂 | Biolab | -- |
| Hitrap Q阴离子交换柱 | GE Healthcare | -- | |
| HiLoad 26/60 Superdex 200凝胶过滤柱 | GE Healthcare | -- | |
| pFastBac载体 | Invitrogen | -- | |
| Dounce组织研磨器 | Sigma-Aldrich | -- | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | -- | |
| Ni2+-氮基三乙酸亲和树脂 | QIAGEN | -- | |
| Superdex 200 Increase 10/300 GL尺寸排阻柱 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 谷胱甘肽树脂 | Sigma-Aldrich | G4510 | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | -- | |
| 泛素化实验 | 体外泛素化检测试剂盒 | Enzo Life Sciences | BML-UW9920-0001 |
| E1连接酶 | Boston Biochem | -- | |
| 动物实验 | 基质胶 | Corning | 354234 |
| DHEA缓释片 | EZBioscience | -- | |
| 多西环素 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 马烯雌酮 | -- | -- | |
| 鹰嘴豆芽素A | -- | -- | |
| 质谱分析 | Q Exactive质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 分子对接 | Schrödinger软件 | Schrödinger | -- |
| 生化筛选 | NAD(P)H-Glo检测系统试剂盒 | Promega | G9061 |
| 牛血清白蛋白 | Thermo Fisher Scientific | 37525 | |
| Envision仪器 | PerkinElmer | -- | |
| 表面等离子共振 | Biacore 8K仪器 | GE Healthcare | -- |
| CM7传感器芯片 | GE Healthcare | -- | |
| 基因表达 | 细胞到cDNA试剂盒 | EZBioscience | -- |
| 2′ SYBR Green qPCR预混液 | EZBioscience | -- | |
| Bio-Rad CFX96实时定量PCR仪 | Bio-Rad | -- | |
| 抗体 | 抗3βHSD1抗体 | Abcam | ab55268 |
| 抗UBE3D抗体 | Abcam | ab121927 | |
| 抗泛素抗体 | Abways | CY5965 | |
| 抗GST抗体 | Cell Signaling Technology | 2624 | |
| 抗MYC抗体 | Millipore | 06-549 | |
| 抗FLAG抗体 | Sigma-Aldrich | H9658 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | ABclonal | AC026 | |
| 药物处理 | 脱氢表雄酮 | Steraloids | -- |
| 双氢睾酮 | Steraloids | -- | |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| G418 | -- | -- | |
| 细胞处理 | 多聚-DL-鸟氨酸 | Sigma-Aldrich | -- |
| 其他 | Acquity Arc系统 | Waters | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 类固醇代谢分析 | 活检组织样本量、[3H]-DHEA浓度、培养时间、HPLC检测条件 阅读提示：方法部分 'Steroidogenesis in patient biopsy samples' |
| 全外显子组和转录组测序 | 样本选择标准、测序平台、比对参数 阅读提示：方法部分 'RNA-Seq'、'DNA extraction and library construction' |
| UBE3D功能实验 | 细胞系、敲低或过表达效率、DHEA处理浓度、检测时间点 阅读提示：方法部分 'Gene expression assay'、'Cell lines and materials' |
| 动物实验 | 小鼠品系、细胞接种数量、DHEA缓释片规格、药物剂量和给药方式 阅读提示：方法部分 'Mouse xenograft studies' |
| 3βHSD1抑制剂筛选 | 筛选浓度、酶反应条件、细胞验证浓度 阅读提示：方法部分 'NAD+-based biochemical screening'、'In vitro 3βHSD1 activity assay' |