建立c-Src条件性敲除的转基因小鼠模型
研究c-Src在乳腺肿瘤发生和进展中的作用
构建了MIC/c-SrcL/L小鼠，通过多西环素诱导PyVmT和Cre表达，实现c-Src在乳腺上皮的特异性、时间可控性敲除。
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c-Src和FOXM1的协同激活驱动肿瘤细胞增殖和乳腺癌进展
Coordinated activation of c-Src and FOXM1 drives tumor cell proliferation and breast cancer progression
实验完整度
高包含基因工程小鼠模型、类器官、细胞系、患者来源异种移植模型及人肿瘤样本等多个证据层级，并进行了功能获得/缺失和药物抑制等验证。
主要模型
MMTV-PyVmT;MMTV-rtTA;MIC转基因小鼠模型 源自MIC小鼠的3D类器官培养 源自PyVmT肿瘤的细胞系 患者来源的异种移植（PDX）模型
重点核对
c-Src的条件性敲除（c-SrcL/L） FOXM1的酪氨酸磷酸化位点（Y239和Y517） FOXM1抑制剂（NB-55、NB-115）和SFK抑制剂（dasatinib、eCF506）的处理 体内实验的给药剂量：dasatinib和eCF506为10 mg/kg口服，NB-55为100 mg/kg口服，NB-115为6 mg/kg皮下注射
摘要
酪氨酸激酶c-Src的激活促进乳腺癌进展和不良预后，但其潜在机制尚未完全阐明。在此，我们表明，在模拟乳腺癌管腔B分子亚型的基因工程模型中，删除c-Src abolished了叉头盒蛋白M1（FOXM1）的活性，FOXM1是细胞周期的主转录调控因子。我们确定c-Src在2个酪氨酸残基上磷酸化FOXM1，以刺激其核定位和靶基因表达。这些靶基因包括G2/M细胞周期进程的关键调控因子以及c-Src本身，形成一个正反馈环路，驱动基因工程和患者来源的管腔B样乳腺癌模型的增殖。使用遗传方法和使FOXM1蛋白去稳定的小分子，我们发现靶向该机制诱导G2/M细胞周期阻滞和凋亡，阻断肿瘤进展，并损害转移。我们在人乳腺癌中鉴定了FOXM1和c-Src表达之间的正相关，并显示FOXM1靶基因的表达预测不良预后，并与管腔B亚型相关，该亚型对当前批准的疗法反应不佳。这些发现揭示了以c-Src和FOXM1为中心的调控网络，是侵袭性管腔乳腺癌的一个可靶向的脆弱性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- c-Src如何驱动乳腺癌进展，其下游机制是什么，以及该机制是否可作为治疗靶点？
- 核心机制
- c-Src磷酸化FOXM1在Y239和Y517位点，促进其核定位和靶基因表达，形成正反馈环路，驱动细胞周期进程和肿瘤进展。
- 主要证据
- 基因工程小鼠模型、类器官、细胞系和PDX模型中的遗传和药理学操作显示，c-Src缺失或FOXM1抑制导致G2/M细胞周期阻滞、凋亡、肿瘤生长抑制和转移减少。
- 研究意义
- 该研究揭示c-Src/FOXM1轴是侵袭性管腔乳腺癌的潜在治疗靶点，FOXM1降解剂可能为这类难治性肿瘤提供新的治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估c-Src缺失对肿瘤发生和转移的影响
确定c-Src在体内肿瘤形成和转移中的必要性
通过触诊和卡尺测量监测肿瘤发生和生长，通过肺组织切片H&E染色评估肺转移。
建立3D类器官培养模型并分析c-Src缺失的表型
离体模拟早期肿瘤进展，研究c-Src缺失对细胞增殖、凋亡和极性的影响
从MIC小鼠乳腺分离上皮细胞，接种于Geltrex包被的玻片上形成类器官，诱导后分析其大小、形态、增殖标志物、凋亡及细胞极性相关蛋白表达。
转录组分析（RNA-Seq）鉴定c-Src下游信号通路
揭示c-Src缺失引起的转录变化，寻找关键下游效应分子
对c-Src+/+和c-SrcL/L类器官进行RNA-Seq，比较差异表达基因，进行通路和转录因子活性分析。
验证FOXM1为c-Src的关键下游靶点
确认FOXM1在c-Src调控细胞周期中的核心作用
通过免疫荧光、Western blot和qRT-PCR检测FOXM1表达和亚细胞定位，分析FOXM1靶基因表达。
研究c-Src对FOXM1的磷酸化作用
确定c-Src是否直接磷酸化FOXM1并影响其功能
通过免疫共沉淀、体外激酶实验、点突变和功能恢复实验，鉴定c-Src磷酸化FOXM1的位点及其对FOXM1核定位和转录活性的影响。
评估FOXM1抑制在体外和体内的治疗效果
检验靶向FOXM1是否可阻断肿瘤细胞增殖和肿瘤进展
使用FOXM1抑制剂（NB-55、NB-115）处理细胞和小鼠模型，检测细胞增殖、细胞周期、凋亡和体内肿瘤生长、转移。
患者样本和公共数据分析c-Src/FOXM1的相关性及临床意义
验证c-Src/FOXM1通路在人乳腺癌中的相关性及其预后价值
分析TCGA数据、人肿瘤组织微阵列（TMA）和PDX模型，检测FOXM1和c-Src表达及相关性、FOXM1靶基因与预后的关联。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物模型 | 多西环素 | Wisent | 450-185-EG |
| 药物处理 | 达沙替尼 | MedChemExpress | HY-10181 |
| eCF506 | MedChemExpress | HY-112096 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Wisent | 319-005-CL |
| 胎牛血清 | Wisent | 080-150 | |
| 表皮生长因子 | Wisent | 511-110-UM | |
| 氢化可的松 | MilliporeSigma | H4001 | |
| 胰岛素 | Wisent | 511-016-UG | |
| 牛垂体提取物 | Hammond CellTech | 1078-NZ | |
| 青霉素/链霉素 | Wisent | 450-200-EL | |
| 类器官培养 | Epicult-B培养基 | STEMCELL Technologies | 05610 |
| 基因敲除血清替代物 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10828010 | |
| Geltrex基质胶 | Thermo Fisher Scientific | A1413202 | |
| 细胞培养 | 胶原酶B | Roche | 11088831001 |
| 分散酶II | Roche | 4942078001 | |
| 胰蛋白酶 | Wisent | 325-143-ES | |
| 嘌呤霉素 | BioShop | PUR333 | |
| 杀稻瘟菌素 | BioShop | BLA477 | |
| 聚凝胺 | MilliporeSigma | 107689 | |
| 分子克隆 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | L3000075 |
| Q5定点突变试剂盒 | New England BioLabs | E0554 | |
| pCW57.1-FOXM1c质粒 | Addgene | 68810 | |
| pMD2.G包装质粒 | Addgene | 12259 | |
| psPAX2包装质粒 | Addgene | 12260 | |
| 基因沉默 | shRNA构建体 | Sigma MISSION | TRCN0000084773; TRCN0000084774; TRCN0000072259 |
| 蛋白提取 | RIPA裂解液 | -- | -- |
| AEBSF | Santa Cruz Biotechnology | sc-202041 | |
| β-甘油磷酸 | MilliporeSigma | G5422 | |
| 原钒酸钠 | BioShop | SOV664 | |
| Episeeker组蛋白提取试剂盒 | Abcam | ab113476 | |
| 蛋白定量 | Bradford蛋白浓度测定试剂盒 | Bio-Rad | 5000006 |
| 免疫沉淀 | FOXM1抗体 | Proteintech | 13147-1-AP |
| c-Src抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8056 | |
| FLAG抗体 | Cell Signaling Technology | 14793 | |
| 正常兔IgG | Cell Signaling Technology | 2729 | |
| PureProteome蛋白A/G磁珠 | MilliporeSigma | LSKMAGAG10 | |
| 免疫荧光 | DAPI染料 | Thermo Fisher Scientific | D1306 |
| ImmPress聚合物检测试剂盒 | Vector Laboratories | VECTMP745250; VECTMP740150; VECTMP740450 | |
| 酪胺信号放大底物 | Akoya Biosciences; PerkinElmer | OP-001001; OP-001303; FP1489 | |
| ImmuMount封片剂 | Thermo Fisher Scientific | 9990412 | |
| Power Block封闭液 | BioGenex | HK083 | |
| BrdU | GE Healthcare | RPN 201 | |
| FOXM1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-376471 | |
| p-Src家族激酶(Y416)抗体 | Cell Signaling Technology | 2101 | |
| 小鼠IgG1同型对照 | Cell Signaling Technology | 2367 | |
| 兔IgG同型对照 | Cell Signaling Technology | 3724 | |
| PLA | DuoLink原位邻位连接试剂盒 | MilliporeSigma | DUO92008 |
| ChIP | SimpleChIP酶法染色质IP试剂盒 | Cell Signaling Technology | 9003 |
| ChIP缓冲液 | Cell Signaling Technology | 7008 | |
| ChIP级别蛋白G磁珠 | Cell Signaling Technology | 9006 | |
| DNA洗脱缓冲液 | Cell Signaling Technology | 10009 | |
| 组蛋白H3抗体 | Cell Signaling Technology | 4620 | |
| qRT-PCR | RNeasy迷你试剂盒 | QIAGEN | 74106 |
| ProtoScript第一链cDNA合成试剂盒 | New England BioLabs | E6300 | |
| LightCycler 480 SYBR Green 1预混液 | Roche | 04887352001 | |
| LightCycler 480实时荧光定量PCR仪 | Roche | -- | |
| 流式细胞术 | EdU | MedChemExpress | HY-118411 |
| TruStain FcX封闭液 | BioLegend | 422302 | |
| BD Cytofix固定液 | BD | 554655 | |
| BD透化/洗涤液 | BD | 554723 | |
| 7-AAD | BioLegend | 420403 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488流式检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| LSR Fortessa流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| FACSDiva软件版本8 | BD Biosciences | -- | |
| 细胞分级分离 | NE-PER细胞分级分离试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 78833 |
| 体外激酶实验 | 活性c-Src激酶 | MilliporeSigma | 14-326 |
| 迁移和侵袭 | Matrigel基质胶 | BD | 356234 |
| Boyden小室 | BD Falcon | -- | |
| 结晶紫 | -- | -- | |
| 组织学 | Aperio XT玻片扫描仪 | Leica Biosystems | -- |
| Zeiss LSM800共聚焦显微镜 | Zeiss | -- | |
| Zeiss Axioscan玻片扫描仪 | Zeiss | -- | |
| Zeiss AxioZoom V16显微镜 | Zeiss | -- | |
| ImmuMount封片剂 | Thermo Fisher Scientific | 9990412 | |
| Permount封片剂 | Thermo Fisher Scientific | SP15-100 | |
| ImageScope软件 | Leica Biosystems | -- | |
| HALO软件 | Indica Labs | -- | |
| ImageJ软件 | NIH | -- | |
| 药物处理 | NB-55 | -- | -- |
| NB-115 | -- | -- | |
| 二甲基亚砜 | -- | -- | |
| 动物模型 | 聚乙二醇400 | -- | -- |
| 吐温-80 | -- | -- | |
| 聚维酮 | -- | -- | |
| 羧甲基纤维素 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 转基因小鼠模型（MIC/c-SrcL/L） | 多西环素给药浓度（2 mg/mL，饮水）和诱导时间；小鼠背景（FVB/NJ）和年龄（8-12周） 阅读提示：Methods: Animal models, Transgenic models |
| 细胞系和类器官培养 | 培养基成分（DMEM补充2% FBS、EGF等）；类器官培养基（Epicult-B, 2% Geltrex）；多西环素浓度（2 μg/mL）和处理时间（12天） 阅读提示：Methods: Cell culture, 3D organotypic culture |
| FOXM1抑制剂和SFK抑制剂处理 | NB-55剂量（100 mg/kg，口服），NB-115剂量（6 mg/kg，皮下），dasatinib和eCF506剂量（10 mg/kg，口服）；给药频率（每日）和治疗时长 阅读提示：Methods: In vivo therapeutic studies, Figure 7 and 10 legends |
| 免疫荧光染色 | 抗体稀释倍数（如FOXM1 1:50, p-SFK 1:200）、抗原修复条件（10 mM EDTA pH 9，高压锅）、二抗和TSA放大系统 阅读提示：Methods: Histology and immunostaining, Supplemental Table 2 |
| PLA实验 | 抗体（FOXM1和p-SFK Y416）来源和稀释倍数；PLA试剂盒（DuoLink）使用条件 阅读提示：Methods: PLA |
| 蛋白免疫印迹 | 细胞裂解和蛋白提取方法（RIPA缓冲液）；抗体列表；荧光成像系统（Li-COR Odyssey） 阅读提示：Methods: Protein extraction and immunoblotting, Supplemental Table 2 |
| qRT-PCR | 总RNA提取方法（RNeasy Mini Kit）；cDNA合成（ProtoScript）；内参基因（ACTB）；引物序列 阅读提示：Methods: qRT-PCR, Supplemental Table 3 |
| 流式细胞术分析细胞周期 | EdU标记浓度和时间（10 μM，3小时）；体内EdU注射剂量（0.1 mg/g）；DNA染色（7-AAD）；细胞染色和固定步骤 阅读提示：Methods: Flow cytometry |
| 转录组分析（RNA-Seq） | RNA质量检测（NanoDrop）；差异表达分析标准（p.adjust < 0.05）；生物信息学工具（Enrichr） 阅读提示：Methods: Transcriptomic analysis |