鉴定疾病相关基因突变
通过家族遗传分析寻找NTG的致病基因突变
对日本一家系11人进行全外显子测序，筛选低频错义突变，结合家系共分离、功能预测和剪接预测，最终确定METTL23 c.A83G (p.E28G)为候选致病突变
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METTL23突变改变正常眼压性青光眼中的组蛋白H3R17甲基化
METTL23 mutation alters histone H3R17 methylation in normal-tension glaucoma
实验完整度
高包含人遗传学分析（WES、Sanger测序）、体外剪接实验、患者iPSC-RGC分化及功能验证、Mettl23敲入/敲除小鼠模型（OCT、ERG、组织学）、体外甲基化实验和机制研究（RT-qPCR、WB、免疫荧光），多个独立证据层级。
主要模型
HEK293T、COS-7、661W细胞系转染模型 NTG患者来源iPSC分化RGC（iPSC-RGC） Mettl23 c.A83G敲入小鼠（Mettl23+/G, Mettl23G/G）和敲除小鼠（Mettl23+/–, Mettl23–/–） 日本NTG家系（3代11人，6名患者）
重点核对
METTL23 c.A83G突变导致METTL23 mRNA异常剪接，产生无功能蛋白 Mettl23敲入和敲除小鼠在正常IOP下表现出进行性RGC变性和视神经轴突损伤 METTL23催化组蛋白H3R17二甲基化（H3R17me2a），调控pS2/PTGES转录 METTL23缺陷导致NF-κB活化，增加TNF-α和IL-1β转录 患者iPSC-RGC显示METTL23表达、H3R17me2a和PS2转录降低
摘要
正常眼压性青光眼（NTG）是一种异质性疾病，其特征为视网膜神经节细胞（RGC）死亡导致视神经乳头凹陷和视野缺损，且眼压（IOP）正常。NTG的发病机制尚不清楚。在此，我们描述了一个日本NTG家系中三代人中鉴定的甲基转移酶样23（METTL23）基因外显子2中的单核苷酸突变。该突变导致METTL23 mRNA异常剪接，从而消除了正常蛋白的产生并改变了亚细胞定位。Mettl23敲入（Mettl23+/G和Mettl23G/G）和敲除（Mettl23+/–和Mettl23–/–）小鼠在无眼压升高的情况下出现了青光眼表型。METTL23是一种组蛋白精氨酸甲基转移酶，在小鼠和猕猴的RGC中表达。然而，该新突变降低了Mettl23G/G小鼠RGC中METTL23的表达，这概括了临床和生物学表型。此外，我们的研究结果表明，METTL23催化视网膜中H3R17的二甲基化，并且是pS2（一种雌激素受体α靶基因）转录所必需的，pS2通过负调控NF-κB介导的TNF-α和IL-1β反馈对RGC稳态至关重要。这些发现提示METTL23在NTG中的病因学作用，具有组织特异性病理。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- METTL23基因突变是否导致正常眼压性青光眼，其病理机制是什么？
- 核心机制
- METTL23作为组蛋白精氨酸甲基转移酶，催化H3R17二甲基化，上调ERα靶基因pS2和PTGES的转录，pS2通过负调控NF-κB介导的TNF-α和IL-1β表达，维持RGC稳态；METTL23功能丧失导致NF-κB信号激活，促炎因子升高，引起RGC死亡
- 主要证据
- 通过WES和Sanger测序鉴定METTL23 c.A83G突变；体外剪接实验、iPSC和敲入小鼠证实异常剪接；敲入和敲除小鼠模型出现RGC变性和视神经损伤；WB显示H3R17me2a减少，RT-qPCR显示PS2下调、TNFA和IL1B上调，免疫组化显示p-NF-κB-p65增加
- 研究意义
- 首次证明组蛋白精氨酸甲基化与青光眼有关，为NTG提供新机制，可能促进通过调控组蛋白甲基化开发新的诊断和治疗策略，并可能对神经退行性疾病有启示
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证突变对mRNA剪接的影响
验证c.A83G突变是否导致异常剪接
构建METTL23 exon 2 minigene，转染HEK293T细胞进行剪接分析；检测患者iPSC和Mettl23敲入小鼠视网膜中的剪接变异
检测突变对蛋白表达和定位的影响
评估突变导致剪接变异对METTL23蛋白表达和亚细胞定位的影响
表达全长和剪接变异体（跳过外显子2或外显子2/3）的FLAG标签质粒，转染HEK293T、COS-7和661W细胞，Western blot检测表达，免疫荧光观察定位
构建Mettl23敲入和敲除小鼠模型并分析表型
确定METTL23突变或缺失是否导致NTG表型
利用CRISPR/Cas9生成Mettl23 c.A83G敲入（KI）和敲除（KO）小鼠；通过OCT测量GCC厚度、ERG测量pSTR幅度、组织学染色（H&E、Brn3a、PPD）评估RGC和视神经损伤
验证METTL23的甲基转移酶活性
证明METTL23催化组蛋白H3R17二甲基化
从转染细胞纯化METTL23全长及剪接变异体蛋白，进行体外甲基化实验；检测小鼠视网膜和细胞中H3R17me2a水平
研究METTL23调控的下游基因及机制
探究METTL23缺陷如何导致RGC损伤
RT-qPCR检测ERα靶基因（PS2, PTGES）和炎症因子（TNFA, IL1B）的表达；免疫组化检测p-NF-κB-p65水平
在患者iPSC分化的RGC中验证
验证c.A83G突变在人类RGC中的效应
将患者和对照iPSC分化为RGC，纯化CD90+细胞，检测METTL23表达、H3R17me2a水平及PS2转录
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 全外显子测序 | 安捷伦SureSelect外显子捕获试剂盒 | Agilent Technologies | -- |
| HiSeq 2500测序仪 | Illumina | -- | |
| 细胞培养 | ViaFect转染试剂 | Promega | -- |
| RNA提取和cDNA合成 | RNeasy Plus微型试剂盒 | QIAGEN | -- |
| High-Capacity cDNA反转录试剂盒 | Applied Biosystems | -- | |
| 剪接分析 | pSpliceExpress载体 | Addgene | 32485 |
| PrimeSTAR HS DNA聚合酶 | TaKaRa | -- | |
| XhoI和XbaI内切酶 | TaKaRa | -- | |
| iPSC培养 | GT-T502培养基 | Kojin Bio | -- |
| 携带OCT3/4、SOX2、KLF4、c-MYC的SeV载体 | Dnavec | -- | |
| Cellartis def-cs 500培养基 | TaKaRa | -- | |
| iPSC-RGC分化 | DMEM/F12培养基（50:50） | -- | -- |
| GlutaMAX添加剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| B27添加剂 | -- | -- | |
| N2添加剂 | -- | -- | |
| XAV939 | -- | -- | |
| SB431542 | -- | -- | |
| LDN193189 | -- | -- | |
| 烟酰胺 | -- | -- | |
| 胰岛素样生长因子1 | -- | -- | |
| 碱性成纤维细胞生长因子 | -- | -- | |
| 音猬因子（SHH）蛋白 | -- | -- | |
| 成纤维细胞生长因子8 | -- | -- | |
| 卵泡抑素300 | -- | -- | |
| 环杷明 | -- | -- | |
| DAPT | -- | -- | |
| Y27632 | -- | -- | |
| 毛喉素 | -- | -- | |
| 环磷酸腺苷 | -- | -- | |
| 脑源性神经营养因子 | -- | -- | |
| 神经营养因子4 | -- | -- | |
| 睫状神经营养因子 | -- | -- | |
| iPSC-RGC分选 | CD90.2磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-121-278 |
| 免疫荧光 | 抗Brn3a抗体 | MilliporeSigma | AB5945 |
| 抗TUBB3抗体 | BioLegend | MMS4359 | |
| 抗METTL23抗体 | Thermo Fisher Scientific | PA5-71814 | |
| 抗H3R17me2抗体 | MilliporeSigma | 07-214 | |
| 抗NF-κB-p65（Ser536）抗体 | Cell Signaling Technology | 3033 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 | Roche | -- | |
| Any kD Mini-PROTEAN TGX凝胶 | Bio-Rad | -- | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| Transblot Turbo转印系统 | Bio-Rad | -- | |
| Can Get Signal和PVDF封闭试剂盒 | TOYOBO | -- | |
| SuperSignal West Femto最大灵敏度底物 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 抗肌动蛋白抗体 | MilliporeSigma | MAB1501 | |
| 抗FLAG抗体 | Cell Signaling Technology | 9A3 | |
| 免疫荧光 | 24孔板盖玻片 | Sumitomo Bakelite | MS-92132 |
| Triton X-100 | -- | -- | |
| 无血清蛋白封闭液 | Dako | -- | |
| Alexa Fluor 568偶联山羊抗小鼠IgG | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Alexa Fluor 488偶联山羊抗兔IgG | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | -- | |
| DAPI | Dojindo | -- | |
| Ultramount水性永久封片剂 | DakoCytomation | -- | |
| 显微观察 | 共聚焦荧光显微镜LSM700 | Zeiss | -- |
| 动物模型生成 | Cas9核酸酶蛋白NLS | NIPPON GENE | -- |
| 单链供体寡核苷酸 | Integrated DNA Technologies (IDT) | -- | |
| EcoRI限制性内切酶 | TaKaRa | -- | |
| BsII限制性内切酶 | TaKaRa | -- | |
| 基因分型 | BigDy Terminator v3.1循环测序试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| ABI 3130 DNA测序仪 | Applied Biosystems | -- | |
| IOP测量 | Icare TONOLAB眼压计 | iCare | -- |
| OCT | Mydrin-P滴眼液 | Santen Pharmaceutical | 1319810Q1053 |
| Micron IV眼底成像系统 | Phoenix Technology Group | -- | |
| OCT分析 | INSIGHT软件 | Phoenix Technology Group | -- |
| ERG | 0.1%透明质酸钠滴眼液 | Santen Pharmaceutical | 1319720Q3078 |
| Ganzfeld刺激器（LS-100） | Mayo | -- | |
| PuREC PC-100记录系统 | Mayo | -- | |
| 组织学 | 福尔马林-醋酸-酒精固定液 | -- | -- |
| 靶标修复液 | DakoCytomation | -- | |
| 免疫组化 | 抗生物素-生物素免疫过氧化物酶检测 | -- | -- |
| 视网膜铺片 | 抗Brn3a抗体（1:200） | MilliporeSigma | AB5945 |
| Alexa Fluor 568偶联兔抗兔IgG | Life Technologies, Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 轴突计数 | Technovit 7100树脂 | Kulzer | RT7100 |
| 蛋白纯化 | Ni-NTA琼脂糖 | QIAGEN | -- |
| 抗FLAG亲和凝胶 | MilliporeSigma | -- | |
| 体外甲基化 | 重组组蛋白H3.1蛋白 | New England BioLabs | M2503S |
| S-腺苷甲硫氨酸 | Abcam | ab142221 | |
| 4× Laemmli SDS上样缓冲液 | Bio-Rad | -- | |
| RT-qPCR | NanoDrop ND-1000分光光度计 | NanoDrop Technologies | -- |
| SsoAdvanced通用SYBR Green超混液 | Bio-Rad | -- | |
| ABI STEP-One实时荧光定量PCR系统 | Life Technologies, Thermo Fisher Scientific | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 突变鉴定与遗传分析 | 家族样本：11人（6例患者，5例未患病）；WES数据；候选变异频率<1%（ExAC, gnomAD, HGVD, 4.7KJPN）；通过PolyPhen2、SIFT、PROVEAN和HSF预测 阅读提示：参见Methods中'Human study participants'和'WES data analysis'，表1和表2 |
| 剪接分析 | HEK293T细胞；minigene构建；转染试剂；48小时收获；RT-PCR和Sanger测序 阅读提示：Methods中'In vitro splicing assay'，图2 |
| iPSC分化RGC | iPSC来源；分化protocol；CD90.2磁珠分选；分化效率（CD90+细胞比例）；免疫荧光和RT-qPCR检测 阅读提示：Methods中'Differentiation and purification of iPSC-RGCs'，图9 |
| Mettl23敲入和敲除小鼠模型 | CRISPR/Cas9设计；供体ssODN；基因型；小鼠品系（C57BL/6J）；分析年龄（2月龄和6月龄）；IOP、OCT、ERG、组织学条件 阅读提示：Methods中'Generation of Mettl23-KI and -KO mice'、'IOP measurement'、'OCT observation'、'ERG'，图3、图5-7 |
| 甲基化活性检测 | 重组H3.1；SAM浓度；反应条件；抗H3R17me2a抗体 阅读提示：Methods中'In vitro methylation assay'，图8 |
| 基因表达分析 | RT-qPCR引物；内参基因（GAPDH）；样本类型（细胞、iPSC、视网膜） 阅读提示：Methods中'RT-qPCR'，补充表7 |