鉴定内皮细胞中NLR传感器的表达
确定内皮细胞中主要表达的NLR传感器及其是否具备形成功能性炎症小体的能力。
通过RNA测序分析HAECs中NLRP1、CARD8、NLRP3等的mRNA表达，并在蛋白水平验证NLRP1、CARD8和ASC的表达。
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病毒蛋白酶激活人体心血管系统中的CARD8炎症小体
Viral proteases activate the CARD8 inflammasome in the human cardiovascular system
实验完整度
高包含体外细胞模型（原代内皮细胞、A549、HEK293T、心肌细胞）实验，涉及CRISPR基因敲除、蛋白酶突变、抑制剂处理、共培养和病毒复制检测，进行了功能验证和机制验证。
主要模型
人主动脉内皮细胞（HAECs） A549细胞 HEK293T-CARD8稳定表达细胞 人胚胎干细胞来源的心肌细胞（HCMs）
重点核对
CARD8敲除（KO）对CVB3诱导的细胞死亡和病毒复制的影响 CVB3 2A和3C蛋白酶对CARD8的切割位点（p.G38）及功能验证 NLRP1和CARD8在VbP刺激下的双重激活及DKO表型 CARD8 KO对内皮-心肌细胞共培养系统中病毒传播的保护作用
摘要
核苷酸结合寡聚化结构域（NBD）、含亮氨酸重复序列（LRR）的蛋白质家族（NLRs）是介导针对感染的先天免疫的细胞内模式识别受体。内皮是抵御血源性病原体的第一道防线，但尚不清楚哪些NLR控制内皮细胞（EC）固有的免疫。在这里，我们证明人类ECs响应DPP8/9抑制剂Val-boro-Pro（VbP）同时激活NLRP1和CARD8炎症小体。肠道病毒柯萨奇病毒B3（CVB3）——病毒性心肌炎的最常见原因——主要以需要病毒2A和3C蛋白酶在CARD8 p.G38处切割以及蛋白酶体功能的方式激活ECs中的CARD8。在ECs和人胚胎干细胞来源的心肌细胞（HCMs）中基因缺失CARD8可减弱CVB3诱导的焦亡、炎症和病毒复制。此外，使用分层的内皮-心肌细胞共培养系统，我们证明ECs中删除CARD8可减少下层心肌细胞的CVB3感染。我们的研究揭示了CARD8炎症小体在内皮固有抗病毒免疫中的独特作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 人类内皮细胞中哪些NLR传感器介导针对病毒感染的固有免疫，以及CVB3如何激活这些传感器？
- 核心机制
- CVB3的2A和3C蛋白酶切割CARD8的N端，导致其N端片段经蛋白酶体降解，从而激活CARD8炎症小体，诱发焦亡和炎症反应。
- 主要证据
- 通过CRISPR/Cas9敲除CARD8、NLRP1和ASC，发现CARD8缺失完全消除CVB3诱导的GSDMD裂解和细胞死亡；通过位点突变证实3C蛋白酶在p.G38处切割CARD8；共培养实验显示CARD8缺失减少心肌细胞感染。
- 研究意义
- 揭示内皮细胞中CARD8炎症小体在抗病毒免疫中的独特作用，提示抑制CARD8可能对CVB3诱导的心肌炎具有治疗潜力。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证VbP激活内皮细胞中的NLRP1和CARD8
测试DPP8/9抑制剂VbP是否能激活内皮细胞中的NLRP1和CARD8，以及它们是否协同驱动焦亡。
用VbP处理HAECs，检测ASC斑点形成、细胞死亡、GSDMD裂解、IL-18分泌；通过CRISPR敲除NLRP1、CARD8、CASP1等进一步验证。
评估CVB3激活CARD8炎症小体
探究CVB3感染是否激活内皮细胞中的NLRP1或CARD8炎症小体，并确定主要传感器。
用CVB3（Nancy株，MOI=0.1）感染HAECs、A549细胞和HCMs，检测细胞死亡、GSDMD裂解、IL-18分泌；比较WT、NLRP1 KO、CARD8 KO、ASC KO等基因型细胞的表型。
阐明CVB3蛋白酶介导CARD8激活的机制
确定CVB3的2A和3C蛋白酶是否直接切割CARD8，以及切割位点和蛋白水解依赖性。
在HEK293T-CARD8细胞中过表达或纯化2A和3C蛋白酶，检测CARD8的切割；通过位点突变确定3C切割位点p.G38；使用蛋白酶体抑制剂验证降解过程。
评估CARD8缺失对病毒复制和炎症的影响
验证CARD8在CVB3感染中对病毒复制、传播和炎症反应的贡献。
比较CARD8 KO和对照HAECs、HCMs的病毒基因组拷贝数、病毒滴度、细胞死亡和炎症基因表达；通过共培养实验评估内皮CARD8缺失对心肌细胞感染的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 内皮细胞生长培养基MV2 | PromoCell | C22022 |
| 胰蛋白酶 | Life Technologies | 25200072 | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| 纤连蛋白 | PromoCell | C43050 | |
| DMEM培养基 | Cytiva | SH30022.01 | |
| 胎牛血清 | Cytiva | SV30160.03HI | |
| 层粘连蛋白-521 | Biolamina | -- | |
| Nutristem培养基 | -- | -- | |
| RPMI培养基 | -- | -- | |
| B27补充剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 药物处理 | Val-boroPro（VbP） | MedChem Express | HY-13233A |
| 脂多糖 | InvivoGen | tlrl-3pelps | |
| 尼日利亚霉素 | MedChem Express | HY-100381 | |
| 硼替佐米 | Cayman Chemical | HY-10227 | |
| 芦平曲韦 | Cayman Chemical | HY-106161 | |
| SNAP | Cayman Chemical | 82250-25 | |
| Z-VAD-FMK | Cayman Chemical | HY-16658B | |
| 双硫仑 | Sigma-Aldrich | PHR1690 | |
| 贝尔纳卡桑 | MedChem Express | HY-13205 | |
| Western blot | 抗NLRP1抗体 | Adipogen | AG-25B-0005-C100 |
| 抗CARD8 C端抗体 | Abcam | ab24186 | |
| 抗CARD8 N端抗体 | Abcam | ab194585 | |
| 抗ASC抗体 | Adipogen | AG-25B-0006-C100 | |
| 抗pro-caspase-1+p10+p12抗体 | Abcam | ab719515 | |
| 抗Gasdermin-D N端抗体 | Abcam | ab215203 | |
| 裂解GSDMD-NT（Asp275）抗体 | Cell Signaling Technology | 36425 | |
| GSDMDC1抗体 | Novus Biologicals | NBP2-33422 | |
| 抗eIF4G（C45A4）抗体 | Cell Signaling Technology | 2469 | |
| 抗PABP抗体 | Proteintech | 10910-1-AP | |
| 抗IL-18抗体 | Abcam | ab201324 | |
| 抗IL-1β抗体 | R&D Systems | AB201 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | A2228-100µl | |
| RNA-seq | NEBNext poly(A) mRNA磁分离模块 | New England Biolabs | E7490L |
| NEBNext UltraTM II定向RNA文库制备试剂盒 | New England Biolabs | E7765L | |
| Illumina HiSeq 2500测序仪 | Illumina | -- | |
| 细胞死亡检测 | SYTOX绿色死细胞染料 | Thermo Fisher Scientific | S34860 |
| Hoechst 33342染料 | Santa Cruz | sc-200908 | |
| LDH检测 | LDH活性检测试剂盒 | Sigma-Aldrich | MAK066 |
| 转染 | 脂质体转染试剂2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 |
| 脂质体转染试剂3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | |
| 病毒包装 | 聚凝胺 | Sigma-Aldrich | 9268 |
| 蛋白检测 | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | 04693159001 | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| SDS-PAGE 4-12%梯度凝胶 | Thermo Fisher Scientific | NW04122BOX | |
| PVDF膜 | Thermo Fisher Scientific | 22860 | |
| 细胞因子检测 | LEGENDplex多因子检测试剂盒 | BioLegend | 740809 |
| 人IL-18 ELISA试剂盒 | Sigma-Aldrich | RAB0543 | |
| RT-qPCR | MN Nucleospin RNA提取试剂盒 | Macherey-Nagel | 740955.50 |
| iScript Select cDNA合成试剂盒 | Bio-Rad | -- | |
| SsoAdvanced通用探针超混液 | Bio-Rad | 1725281 | |
| CFX96 Touch实时PCR检测系统 | Bio-Rad | -- | |
| qPCR | Quick-RNA MicroPrep提取试剂盒 | Zymo Research | R1051 |
| Luna通用探针一步法RT-qPCR试剂盒 | New England Biolabs | E3006X | |
| iScript RT超混液 | Bio-Rad | 1708841 | |
| iTaq通用SYBR Green超混液 | Bio-Rad | 1725124 | |
| 免疫荧光 | FIX & PERM细胞透化试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | GAS004 |
| 抗肌动蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | A7811 | |
| Alexa Fluor 568二抗 | Invitrogen | A11004 | |
| Alexa Fluor 647二抗 | Invitrogen | A21244 | |
| DAPI染料 | Invitrogen | D1306 | |
| LSM710蔡司共聚焦显微镜 | Carl Zeiss | -- | |
| 流式 | 近红外活/死染料 | Life Technologies | L10119 |
| 抗ICAM1-PE抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-107 | |
| 抗VCAM1-PE-Vio770抗体 | Miltenyi Biotec | 130-104-127 | |
| LSRFortessa流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| 病毒实验 | 柯萨奇病毒B3（Nancy株） | ATCC | VR-30 |
| Timer-CVB3重组病毒 | -- | -- | |
| 病毒滴度 | Aquacide II | Chromadex | CFAH-17851 |
| 结晶紫溶液 | Sigma-Aldrich | V5265 | |
| 其他 | Triton X-100 | Merck | T8787-250 |
| 多聚赖氨酸 | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| G418 | Santa Cruz | sc-29065A | |
| 嘌呤霉素 | InvivoGen | ant-pr-1 | |
| 共培养 | Transwell小室（CLS3401） | Sigma-Aldrich | CLS3401 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞类型、来源、培养基、传代密度 阅读提示：Materials and methods: Cell culture and reagents used |
| 药物处理 | VbP浓度、处理时间、溶剂（DMSO/0.1% TFA） 阅读提示：Materials and methods: Reagents and antibodies, Cell death assay |
| 病毒感染 | CVB3毒株、MOI、感染时间、病毒制备方法 阅读提示：Materials and methods: Preparation of CVB3, CVB3 infection |
| 基因敲除 | CRISPR gRNA序列、载体、转导MOI、筛选浓度和时间 阅读提示：Materials and methods: CRISPR/Cas9 gene editing, Generation of stable cell lines |
| 机制验证 | 蛋白酶抑制剂种类、浓度、处理时间 阅读提示：Figure 3 legend and Figure S3 legend |
| 共培养实验 | Transwell孔径、细胞数量、共培养时间、病毒接种方式 阅读提示：Materials and methods: Timer-CVB3 infected HAECs-HCM co-culture |