建立高TMB的Msh2 KO肺癌模型
利用CRISPR/Cas9敲除Msh2，增加肿瘤突变负荷，模拟免疫检查点抑制剂敏感但易耐药的肿瘤。
使用CRISPR/Cas9在LKR13和368T1细胞中敲除Msh2，通过全外显子测序筛选出低（L）和高（H）TMB的克隆，并在体外和免疫缺陷小鼠中验证其生长特性。
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缺氧与肺癌免疫检查点抑制剂获得性耐药相关
Hypoxia is linked to acquired resistance to immune checkpoint inhibitors in lung cancer
实验完整度
高包含体外细胞实验、体内小鼠模型、单细胞转录组、免疫肽组学及患者队列分析，并有功能验证（TH-302延迟耐药）和机制验证（缺氧抑制MHC-II）。
主要模型
小鼠LKR13-H（Msh2 KO）肺腺癌细胞系皮下移植瘤模型 小鼠368T1（Msh2 KO）肺腺癌细胞系皮下移植瘤模型 NSCLC患者临床队列（SU2C-MARK cohort）
重点核对
Msh2 KO LKR13-H肿瘤对ICIs（抗PD-1+抗CTLA-4）的应答及获得性耐药（治疗起始于肿瘤体积30-50mm3时） T细胞（CD4+和CD8+）和IFNγ在应答与耐药肿瘤中的丰度及功能 癌细胞MHC-I和MHC-II表面表达水平（流式细胞术） 肿瘤缺氧程度（pimonidazole染色） TH-302（50 mg/kg，隔天给药）与ICIs联合治疗对耐药出现时间的影响
摘要
尽管免疫检查点抑制剂（ICIs）已确立用于治疗非小细胞肺癌（NSCLC），但只有一部分患者从中获益，且约50%最初肿瘤缓解的患者最终会发展为获得性耐药（AR）。为了确定AR的新驱动因素，我们生成了小鼠Msh2敲除（KO）肺癌肿瘤，这些肿瘤最初对抗PD-1单药或联合抗CTLA-4治疗有反应，但最终发展为AR。耐药肿瘤浸润T细胞减少，癌细胞内在MHC-I和MHC-II水平降低，但对IFNγ仍有反应。耐药肿瘤含有广泛的缺氧区域，由耐药癌细胞单细胞转录谱分析得出的缺氧特征与接受抗PD-1/PD-L1治疗的NSCLC患者队列中无进展生存期缩短相关。使用缺氧激活的前药靶向缺氧肿瘤区域可延迟小鼠Msh2 KO肿瘤对ICIs的AR。因此，这项工作为联合免疫检查点抑制靶向肿瘤代谢特征（如缺氧）提供了理论依据。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 驱动非小细胞肺癌对免疫检查点抑制剂获得性耐药的新机制是什么？
- 核心机制
- 获得性耐药肿瘤中缺氧增加，通过促进T细胞排斥和抑制癌细胞MHC-II表达（部分通过降低IFNγ可用性和癌细胞内在机制）导致免疫逃逸，而缺氧激活的前药TH-302可靶向缺氧区域，延迟耐药出现。
- 主要证据
- 在小鼠Msh2 KO LKR13-H肿瘤模型中，耐药肿瘤表现出缺氧（pimonidazole染色增加）、TILs减少、MHC-II表达降低，且保留IFNγ反应性；NSCLC患者队列中缺氧特征与无进展生存期缩短相关；TH-302联合ICIs治疗延迟了耐药出现。
- 研究意义
- 为联合靶向肿瘤代谢特征（如缺氧）与免疫检查点抑制以延迟或克服获得性耐药提供了理论依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估Msh2 KO肿瘤对ICIs的反应及T细胞依赖性
确定高TMB的Msh2 KO肿瘤是否对ICIs有反应，并验证这种反应是否依赖T细胞。
在免疫活性B6129SF1/J小鼠中皮下接种肿瘤细胞，用抗PD-1+抗CTLA-4处理，并设置T细胞清除组，观察肿瘤生长和免疫指标。
诱导并验证获得性耐药
通过长期ICIs治疗使LKR13-H肿瘤产生获得性耐药，并确认耐药表型是可传递的。
对LKR13-H肿瘤长期用抗PD-1或抗PD-1+抗CTLA-4治疗，收集耐药肿瘤（早晚期），并通过移植肿瘤片段或CD45-细胞到新受体小鼠验证耐药性。
分析耐药肿瘤的转录和免疫特征
通过单细胞RNA测序和流式细胞术，揭示耐药肿瘤中T细胞和癌细胞的转录及功能变化。
对Iso、应答及耐药肿瘤进行scRNAseq和流式分析，比较T细胞亚群、功能状态及癌细胞MHC-I/II表达。
鉴定缺氧为耐药特征并验证其对MHC-II的影响
发现耐药肿瘤富集缺氧基因集，并验证缺氧是否直接影响癌细胞MHC-II表达。
对癌细胞进行GSEA分析，发现缺氧基因集富集；用pimonidazole染色和2-NBDG摄取验证缺氧和糖酵解；在体外模拟低氧条件，检测IFNγ诱导的MHC-II表达。
评估缺氧靶向治疗对耐药延迟的影响
检验TH-302（缺氧激活前药）与ICIs联用是否延迟获得性耐药的出现。
LKR13-H肿瘤小鼠分为Iso、ICIs、TH-302、ICIs+TH-302组，长期治疗，观察肿瘤生长和耐药出现时间。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Thermo Fisher Scientific | 21870-076 |
| 胎牛血清 | Gibco | 16140071 | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| 基因编辑 | PX458载体 | Addgene | 48138 |
| Lipofectamine 2000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | 11668030 | |
| 免疫印迹 | Msh2抗体（N末端） | Cell Signaling | 2017 |
| Msh2抗体（C末端） | Abcam | 70270 | |
| β-actin抗体 | Santa Cruz | 47778 | |
| 体外IFNγ刺激 | 重组小鼠IFNγ | R&D Systems | 485-MI-100 |
| 流式分析 | MHC-II抗体 (APC) | BioLegend | 107614 |
| MHC-I抗体 (PE) | BioLegend | 114507 | |
| PD-L1抗体 (PE-Cy7) | BioLegend | 124314 | |
| 动物实验 | 抗PD-1抗体 (克隆RMP1-14) | BioXCell | BE0146 |
| 抗CTLA-4抗体 (克隆9H10) | BioXCell | BE0131 | |
| IgG2a同型对照 | BioXCell | BE0089 | |
| 多克隆叙利亚仓鼠IgG同型对照 | BioXCell | BE0087 | |
| TH-302（依沃磷酰胺） | Sigma-Aldrich | ATE448430720 | |
| 缺氧检测 | 哌莫硝唑 | Hypoxyprobe | HP-200 |
| 免疫清除 | 抗CD4抗体 (克隆GK1.5) | BioXCell | BE0003-1 |
| 抗CD8抗体 (克隆53-6.7) | BioXCell | BE0004-1 | |
| 抗IFNγ抗体 (克隆XMG1.2) | BioXCell | BP0055 | |
| 免疫肽组学 | IV型胶原酶 | Sigma-Aldrich | S5138 |
| 脱氧核糖核酸酶 | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| 流式分析 | 2-NBDG（荧光葡萄糖类似物） | Abcam | 235976 |
| 抗哌莫硝唑抗体 (FITC) | Hypoxyprobe | HP2 | |
| 免疫荧光 | 抗CD3抗体 | Spring Biosciences | -- |
| 抗兔AlexaFluor594二抗 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Hoechst-33342染色液 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 免疫组化 | 抗HMGB1抗体 | Cell Signaling Technology | 6893 |
| 抗Bcl-2抗体 | Abcam | ab182858 | |
| 单细胞测序 | Chromium系统 | 10x Genomics | -- |
| Cell Ranger软件 | 10x Genomics | -- | |
| 免疫肽组学 | 抗小鼠H2 (M1/42.3.9.8) MHC I类抗体 | BioXCell | BE0077 |
| 抗小鼠H2-IAd/IEd (M5/114) MHC II类抗体 | BioXCell | BE0108 | |
| Polyprep色谱柱 | Bio-Rad | 7311553 | |
| CNBr活化Sepharose 4B | Fisher | 45000066 | |
| Dynamag-2磁力架 | Invitrogen | 12321D | |
| Protein LoBind管 (1.5 ml) | Eppendorf | 022431081 | |
| Protein LoBind管 (2 ml) | Eppendorf | 02243100 | |
| Costar微量离心管 (2.0 ml) | Corning | 3213 | |
| Falcon管 (15 ml) | Corning | 352096 | |
| Ultramicrospin C18柱 | The Nest Group | SEMSS18V | |
| 甲酸 | Fisher | AC147930010 | |
| CHAPS去污剂 | Fisher | 22020110GM | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Fisher | 28372 | |
| 碳酸氢铵 | Fisher | A643-500 | |
| 脱氧胆酸钠 | Fisher | 89905 | |
| 无EDTA复合抑制剂 | Bio-Rad | A32961 | |
| 流式分析 | CD45抗体 (BV711) | BioLegend | 103147 |
| CD3抗体 (APC-Cy7) | BioLegend | 100222 | |
| CD4抗体 (BUV737) | BD Biosciences | 612761 | |
| CD8抗体 (BV605) | BD Biosciences | 563152 | |
| CD44抗体 (PerCP) | BioLegend | 103035 | |
| Foxp3抗体 (APC) | eBioscience | 17-5773-82 | |
| IFNγ抗体 (PE-Cy7) | BioLegend | 505826 | |
| Live/Dead红色可固定活力染料 | Thermo Fisher Scientific | L34973 | |
| 单细胞测序 | CD45抗体 (PacificBlue) | BioLegend | 103126 |
| CD8抗体 (PE) | BioLegend | 100512 | |
| CD4抗体 (PE) | BioLegend | 100708 | |
| 质谱分析 | Easy nLC-1200纳升液相色谱 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Orbitrap Eclipse质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 数据分析 | PEAKS X软件 | Bioinformatics Solutions | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系（LKR13和368T1）来源及Msh2敲除克隆的选择（L/H TMB），培养基成分（RPMI-1640、10% FBS、1% Pen/Strep），培养条件（37°C、5% CO2） 阅读提示：Materials and methods: Generation and analysis of Msh2 KO cells |
| 小鼠模型 | 小鼠品系（B6129SF1/J、NSG、Rag1KO），细胞接种量（500,000个），皮下注射部位，治疗起始时间（平均体积30-50 mm3时，约第10天） 阅读提示：Materials and methods: Animal studies |
| ICIs治疗 | 抗体克隆（anti-PD-1 RMP1-14、anti-CTLA-4 9H10），剂量（250 μg/次），给药频率（每周两次），给药方式（腹腔注射） 阅读提示：Materials and methods: Treatments |
| TH-302处理 | TH-302剂量（50 mg/kg），给药频率（隔天一次），给药方式（腹腔注射），注射溶剂 阅读提示：Materials and methods: Treatments |
| 缺氧检测 | pimonidazole剂量（80 mg/kg），注射时间（处死前90分钟），检测方法（流式或免疫荧光），量化方式（QuPath） 阅读提示：Materials and methods: Treatments, Immunofluorescence and immunohistochemistry |
| 免疫表型分析 | 抗体克隆及稀释比例，染色条件，流式细胞仪设置，死活染料使用 阅读提示：Materials and methods: Immunophenotyping via flow cytometry |
| 单细胞RNA测序 | 细胞分选方案（CD45+CD3+CD4/8+ T细胞、CD45+CD3-CD4/8-其他免疫细胞、CD45-癌细胞按2:1:1混合），10x Genomics loading细胞数（17,000/条件），测序深度（300百万reads/样本） 阅读提示：Materials and methods: scRNAseq |
| 免疫肽组学 | 细胞数量（1×10^8/样本），裂解缓冲液成分，抗体偶联珠子（MHC-I和MHC-II），质谱参数，鉴定软件（PEAKS X） 阅读提示：Materials and methods: Immunopeptidomics |