人HMDMs和病变巨噬细胞中rs9349379基因型与PHACTR1表达及胞葬作用的相关性分析
验证rs9349379-G是否与较低的巨噬细胞PHACTR1表达和受损的胞葬作用相关。
从健康供体获得HMDMs，基因分型后检测PHACTR1 mRNA和蛋白水平，并评估对PKH26标记ACs的吞噬。同时，对人颈动脉斑块进行基因分型、免疫荧光染色检测PHACTR1和CD68，并评估TUNEL+细胞与巨噬细胞的相关性。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
巨噬细胞PHACTR1缺陷损害胞葬作用并促进动脉粥样硬化斑块坏死
Deficiency of macrophage PHACTR1 impairs efferocytosis and promotes atherosclerotic plaque necrosis
实验完整度
高包含人原代巨噬细胞、人颈动脉斑块、骨髓移植小鼠模型、体外机制实验（免疫沉淀、突变体回补）等多层级证据，并进行功能验证。
主要模型
人单核细胞来源巨噬细胞（HMDMs） 人颈动脉粥样硬化斑块组织 骨髓来源巨噬细胞（BMDMs） Ldlr–/–小鼠骨髓移植动脉粥样硬化模型
重点核对
rs9349379基因型（AA、AG、GG） PHACTR1表达水平（mRNA和蛋白） 胞葬作用（AC吞噬）效率 磷酸化MLC水平 PP1α核转位
摘要
胞葬作用是凋亡细胞（ACs）通过肌动蛋白介导的吞噬作用被巨噬细胞清除的过程，可防止继发性坏死、抑制炎症并促进消退。胞葬作用受损驱动临床上危险的坏死性动脉粥样硬化斑块的形成，这是冠状动脉疾病（CAD）的潜在病因。编码PHACTR1的基因的内含子包含rs9349379（A>G），这是一个与CAD相关的常见变异。由于PHACTR1是一种肌动蛋白结合蛋白，我们推测如果rs9349379风险等位基因G导致巨噬细胞中PHACTR1表达降低，则可能通过损害胞葬作用将风险等位基因与CAD联系起来。我们在此显示，与rs9349379-A/A相比，rs9349379-G/G与人单核细胞来源的巨噬细胞和人动脉粥样硬化病变巨噬细胞中较低的PHACTR1水平和受损的胞葬作用相关。在人、小鼠巨噬细胞中沉默PHACTR1损害了AC的吞噬，且西方饮食喂养的造血Phactr1基因靶向的Ldlr–/–小鼠显示出病变胞葬作用受损、斑块坏死增加和纤维帽变薄——这些都是人类易损斑块的标志。机制上，PHACTR1防止肌球蛋白轻链（MLC）去磷酸化，这对AC吞噬是必需的。总之，rs9349379-G降低PHACTR1，通过降低磷酸化MLC而损害胞葬作用。因此，rs9349379-G可能至少部分通过损害动脉粥样硬化病变巨噬细胞胞葬作用而促成CAD风险。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- rs9349379风险等位基因G是否通过降低巨噬细胞PHACTR1表达损害胞葬作用，从而促进动脉粥样硬化斑块坏死和CAD风险？
- 核心机制
- PHACTR1通过将PP1α隔离在细胞核中，防止细胞质MLC去磷酸化，维持磷酸化MLC水平，从而促进肌动蛋白介导的AC吞噬。rs9349379-G降低PHACTR1表达，导致磷酸化MLC降低、胞葬作用受损。
- 主要证据
- 人HMDMs和病变巨噬细胞中GG基因型PHACTR1表达降低和胞葬作用受损；siRNA沉默PHACTR1降低胞葬作用；Phactr1缺乏BMDMs胞葬作用受损且PP1α沉默可恢复；骨髓移植小鼠模型显示病变胞葬作用降低、坏死增加。
- 研究意义
- 该研究将rs9349379-G与CAD风险通过巨噬细胞胞葬作用受损联系起来，提示增强PHACTR1表达的治疗策略可能作为基于人类遗传学的动脉粥样硬化新疗法。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
siRNA沉默PHACTR1对HMDMs和BMDMs胞葬作用的影响
确认PHACTR1缺失是否直接导致胞葬作用受损。
用siRNA沉默HMDMs和BMDMs中的PHACTR1，在基础或IFN-γ/LPS刺激条件下检测AC吞噬、AC结合、细菌和微球吞噬，并通过LifeAct-RFP观察肌动蛋白杯形成。
PHACTR1-PP1α-MLC机制验证
阐明PHACTR1促进胞葬作用的分子机制。
检测AC刺激下的PP1α免疫沉淀、MLC磷酸化，以及PHACTR1和PP1α的核质定位。使用PP1α siRNA、MLC siRNA、组成性激活MLC突变体和PHACTR1突变体（ΔB1、ΔC）回补实验。
体内验证：骨髓移植小鼠模型
验证造血细胞PHACTR1缺乏是否在体内损害胞葬作用并促进斑块坏死。
将Phactr1+/+、+/–或–/–骨髓移植到Ldlr–/–小鼠，喂食西方饮食，分析主动脉根部斑块。同时进行地塞米松诱导胸腺凋亡模型检测胸腺巨噬细胞胞葬作用。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | GIBCO | -- |
| 青霉素-链霉素 | Corning | -- | |
| 胎牛血清 | GIBCO | -- | |
| Histopaque分离液 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 细胞分化 | 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 | PeproTech | -- |
| 细胞处理 | 脂多糖 | Sigma-Aldrich | -- |
| 干扰素-γ | PeproTech | -- | |
| 染料 | PKH26红色荧光染料 | Sigma-Aldrich | -- |
| 吞噬实验 | DiI标记的氧化型低密度脂蛋白 | Invitrogen | -- |
| 荧光标记 | Hoechst染料 | Cell Signaling Technology | -- |
| 免疫印迹 | PHACTR1抗体 | Novus | NBP1-84232 |
| PHACTR1抗体 | Abcam | ab229120 | |
| GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 8884S | |
| 肌球蛋白轻链抗体 | Abcam | ab79935 | |
| PP1抗体 | Abcam | ab150782 | |
| MYC标签抗体 | Cell Signaling Technology | 2272S | |
| 免疫沉淀 | Protein G磁珠 | Cell Signaling Technology | -- |
| PP1α抗体 | Thermo Fisher Scientific | 43-8100 | |
| 转染 | INTERFERin转染试剂 | Polyplus-transfection | -- |
| 瞬时转染 | LifeAct-RFP质粒 | -- | Addgene plasmid 54586 |
| 电穿孔 | Neon转染系统 | Invitrogen | -- |
| RNA提取 | RNeasy试剂盒 | QIAGEN | -- |
| cDNA合成 | cDNA合成试剂盒 | Applied Biosystems | -- |
| qPCR | SYBR Green试剂 | Applied Biosystems | -- |
| 基因分型 | TaqMan SNP基因分型试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 核质分离 | NE-PER核质提取试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 动物实验 | 地塞米松 | Sigma-Aldrich | -- |
| 新霉素 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 动物饲料 | 西方饮食 | Envigo | -- |
| 免疫组化 | CD68抗体 | DAKO | M0814 |
| Mac2抗体 | Cedarlane | CL8942LE | |
| 磷酸化MLC2抗体 | Cell Signaling Technology | 3671 | |
| 总MLC2抗体 | Abcam | ab79935 | |
| TUNEL染色 | TUNEL染色试剂盒 | Roche | -- |
| 胶原染色 | 天狼星红 | Polysciences | -- |
| 血液分析 | 甘油三酯检测试剂盒 | Wako | -- |
| 胆固醇检测试剂盒 | Wako | -- | |
| 血糖测量 | OneTouch Ultra血糖仪 | Lifescan | -- |
| 血细胞计数 | FORCYTE血液分析仪 | Oxford Science | -- |
| 显微成像 | Leica荧光显微镜DMI6000B | Leica | -- |
| 共聚焦成像 | Zeiss LSM 880 NLO共聚焦显微镜 | Carl Zeiss Microscopy | -- |
| 流式细胞术 | FACSCanto II流式细胞仪 | BD | -- |
| 图像分析 | ImageJ软件 | NIH | -- |
| Fiji软件 | -- | -- | |
| qPCR仪器 | 7500实时PCR系统 | Applied Biosystems | -- |
| 蛋白质电泳 | Laemmli裂解缓冲液 | Bio-Rad | -- |
| 4–20% SDS-PAGE梯度胶 | Invitrogen | -- | |
| 硝酸纤维素膜 | Bio-Rad | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 人单核细胞来源巨噬细胞制备与处理 | 供体rs9349379基因型；GM-CSF分化时间（7-14天）；IFN-γ和LPS浓度及处理时间（20 ng/mL, 1 ng/mL, 24小时） 阅读提示：Methods: Human monocyte–derived macrophages; LPS and IFN-γ stimulation |
| 胞葬作用检测 | AC比例（5:1）、孵育时间（45分钟）、PKH26标记方法 阅读提示：Methods: In vitro efferocytosis assay |
| PHACTR1沉默 | siRNA序列（靶向外显子3,14,15或11,12,13）、转染试剂（INTERFERin）、siRNA浓度（10 nM）、处理时间（3天） 阅读提示：Methods: siRNA-mediated gene silencing |
| 小鼠动脉粥样硬化模型 | 受体小鼠品系（Ldlr–/–）及周龄（8周）、辐照剂量（10 Gy）、骨髓细胞数量（5×10^6）、西方饮食时长（8周或12周）、移植后恢复时间（4周） 阅读提示：Methods: Mouse atherosclerosis study |
| 体内胞葬作用定量 | TUNEL+细胞与Mac2+细胞关联判断标准 阅读提示：Methods: In situ efferocytosis |