体内验证内皮Gs信号对肿瘤生长的影响
确定内皮Gαs在肿瘤进展中的作用。
在EC-Gαs-KO小鼠中皮下注射B16-F10或LLC1肿瘤细胞，监测肿瘤生长，并通过免疫组化分析增殖、血管密度、覆盖、凋亡及缺氧区域；将EC-Gαs-KO与MMTV-PyMT杂交研究自发乳腺癌。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
肾上腺髓质素抑制CCL2血管分泌功能促进肿瘤生长
Suppression of CCL2 angiocrine function by adrenomedullin promotes tumor growth
实验完整度
高包含体内转基因小鼠肿瘤模型（B16-F10、LLC1、E0771、MMTV-PyMT）与体外共培养（HUVEC/MLEC与肿瘤细胞）、siRNA/shRNA敲低及RNA-seq转录组分析，并进行功能与机制验证。
主要模型
HUVEC与人黑色素瘤MeWo细胞共培养模型 MLEC与小鼠B16-F10或LLC1细胞共培养模型 C57BL/6N背景的EC-Gαs-KO、EC-Calcrl-KO、EC-Ccl2-KO及双敲除小鼠皮下/原位肿瘤模型 MMTV-PyMT自发乳腺癌模型
重点核对
肿瘤细胞来源的肾上腺髓质素通过内皮CALCRL/Gs信号促进肿瘤生长 内皮Gs/cAMP信号抑制CCL2表达，CCL2通过肿瘤细胞CCR2抑制肾上腺髓质素形成 内皮CCL2缺失或肿瘤细胞CCR2缺失恢复EC-Gαs-KO小鼠的肿瘤生长表型 体外共培养模型中，内皮Gαs或CALCRL敲低抑制内皮及肿瘤细胞增殖，而肿瘤细胞肾上腺髓质素敲低减少内皮增殖 内皮Gαs缺失上调内皮CCL2表达，而肾上腺髓质素处理下调CCL2表达
摘要
在肿瘤微环境中，肿瘤细胞和内皮细胞相互调节。虽然肿瘤细胞诱导内皮细胞的血管生成反应，但内皮细胞释放血管分泌因子，这些因子作用于肿瘤细胞和其他基质细胞。我们报道肿瘤细胞来源的肾上腺髓质素具有促血管生成以及直接的促肿瘤作用，并且内皮来源的CC趋化因子配体2（CCL2）抑制肾上腺髓质素诱导的肿瘤细胞增殖。内皮肾上腺髓质素受体CALCRL或G蛋白Gs的缺失减少了内皮增殖。令人惊讶的是，内皮CALCRL或Gs缺失后肿瘤细胞增殖也减少。我们确定CCL2是一种关键的血管分泌因子，其形成受肾上腺髓质素抑制。此外，CCL2通过其受体CCR2抑制肿瘤细胞中肾上腺髓质素的形成。一致地，内皮CCL2或肿瘤细胞CCR2的缺失使内皮CALCRL或Gs缺失小鼠中减少的肿瘤生长恢复正常。我们的发现显示了肾上腺髓质素的促肿瘤作用，并确定CCL2是一种控制肿瘤细胞形成肾上腺髓质素的血管分泌因子。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 肿瘤微环境中，肿瘤细胞来源的肾上腺髓质素如何通过作用于内皮细胞促进肿瘤生长？
- 核心机制
- 肿瘤细胞来源的肾上腺髓质素激活内皮细胞Gs偶联受体CALCRL，通过cAMP信号抑制内皮CCL2的形成与释放，从而解除CCL2对肿瘤细胞肾上腺髓质素表达的抑制作用（CCL2经CCR2抑制肾上腺髓质素），形成自我增强的促肿瘤正反馈循环。
- 主要证据
- 体外共培养中，内皮Gs或Calcrl敲低减少肿瘤细胞诱导的内皮增殖及肿瘤细胞增殖；肾上腺髓质素抑制内皮CCL2表达（qRT-PCR、ELISA）。体内EC-Gαs-KO和EC-Calcrl-KO小鼠肿瘤生长减慢、血管密度降低，而ECs失去Gαs或Calcrl时CCL2表达上调。EC-Gαs/Ccl2-dKO或肿瘤CCR2敲低使EC-Gαs-KO的肿瘤生长恢复。
- 研究意义
- 揭示肿瘤细胞与内皮细胞间肾上腺髓质素-CCL2正反馈调控轴，提示增强内皮CCL2形成可能成为抑制肿瘤生长的策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外共培养验证内皮Gαs和CALCRL对细胞增殖的作用
验证内皮Gs信号及CALCRL是否影响内皮和肿瘤细胞增殖。
siRNA敲低HUVEC或MLEC中Gnas或Calcrl，与GFP标记的肿瘤细胞共培养，通过Ki67染色、GFP免疫荧光或Western blot测量增殖，TUNEL检测凋亡。
识别Gαs上游受体及配体来源
确定介导内皮反应的GPCR及肾上腺髓质素的来源。
siRNA筛选23种Gs偶联受体，敲低候选基因后检测内皮增殖；在HUVEC或肿瘤细胞中特异性敲低ADM表达，检测共培养中细胞增殖和肾上腺髓质素水平。
验证肾上腺髓质素对CCL2表达的调控
研究肾上腺髓质素/Gs/cAMP信号对CCL2表达的影响。
qRT-PCR检测肾上腺髓质素或db-cAMP处理后HUVEC中CCL2表达；Western blot检测共培养中肾上腺髓质素和CCL2水平；RNA-seq比较对照与Gαs敲低内皮细胞的转录组。
验证CCL2对肿瘤细胞肾上腺髓质素形成的抑制作用
确定内皮CCL2是否通过CCR2抑制肿瘤细胞肾上腺髓质素表达。
用CCL2处理肿瘤细胞，敲低CCR2或用PTX预处理，检测肾上腺髓质素表达；在共培养中敲低内皮CCL2或肿瘤CCR2，检测肿瘤增殖和肾上腺髓质素水平。
体内验证内皮CCL2及肿瘤CCR2的作用
证明内皮CCL2抑制肿瘤生长的作用及其对肾上腺髓质素形成的调控。
在EC-Ccl2-KO、EC-Gαs/Ccl2-dKO小鼠中注射B16-F10细胞；在EC-Gαs-KO小鼠中注射CCR2敲低的肿瘤细胞，监测肿瘤生长；Western blot和免疫组化检测相关蛋白。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
验证免疫效应
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | 肾上腺髓质素 | Sigma-Aldrich | A-2327 |
| 百日咳毒素 | Sigma-Aldrich | P7208 | |
| 双丁酰环磷酸腺苷 | Merck Chemicals GmbH | 28745 | |
| 肾上腺髓质素22-52片段 | Bachem | H-4144 | |
| 人重组CCL2 | Bio-Techne GmbH | 279-MC | |
| 小鼠重组CCL2 | Bio-Techne GmbH | 479-JE | |
| 细胞培养 | 基质胶 | Corning BV | 356237 |
| 内皮细胞生长培养基-2 | Lonza | -- | |
| 内皮细胞生长培养基-2-MV | Lonza | -- | |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| Opti-MEM培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 脂质体转染试剂RNAiMAX | Invitrogen | -- | |
| siRNA敲低 | 靶向人CALCRL的siRNA | Sigma-Aldrich | EHU003121 |
| 靶向人CCR2的siRNA | Sigma-Aldrich | EHU109141 | |
| 靶向人GPR125的siRNA | Sigma-Aldrich | EHU085311 | |
| 靶向人FZD6的siRNA | Sigma-Aldrich | EHU074771 | |
| 靶向人TM7SF3的siRNA | Sigma-Aldrich | EHU049511 | |
| 靶向小鼠Calcrl的siRNA | Sigma-Aldrich | EMU054511 | |
| pLV-Puro-U6表达载体 | VectorBuilder | -- | |
| 慢病毒感染 | pLV-Bsd-EF1A表达载体 | VectorBuilder | VB210426-1127uue |
| TUNEL检测 | Click-iT TUNEL Alexa Fluor 594成像试剂盒 | Invitrogen | C10246 |
| ELISA | 肾上腺髓质素ELISA试剂盒 | BIOZOL Diagnostica Vertrieb GmbH | LS-F6083-1 |
| 人MCP-1/CCL2非包被ELISA试剂盒 | Invitrogen | 88-7399-22 | |
| Western blot | 磷酸酶抑制剂 | Roche | -- |
| 抗GFP抗体 | Chromotek | 3H9 | |
| 抗肾上腺髓质素抗体 | LS Bio | LS-B15534 | |
| 抗微管蛋白抗体 | Cell Signaling | 2521 | |
| 抗Gαs抗体 | Santa Cruz | sc-1359 | |
| ECL化学发光底物 | Pierce | -- | |
| RNA-seq | miRNeasy Micro试剂盒 | Qiagen | -- |
| 无DNase的DNase套装 | Qiagen | -- | |
| TruSeq链特异性mRNA文库制备试剂盒 | Illumina | -- | |
| NextSeq500测序仪 | Illumina | -- | |
| LabChip Gx Touch 24微流控芯片仪 | PerkinElmer | -- | |
| qRT-PCR | Quick-RNA Micro提取试剂盒 | Zymo | -- |
| ProtoScript II反转录试剂盒 | New England BioLabs | M0368S | |
| Light-Cycler 480探针大师系统 | Roche | -- | |
| LightCycler480实时荧光定量PCR仪 | Roche | -- | |
| Nanodrop ND-100分光光度计 | -- | -- | |
| 动物实验 | 他莫昔芬 | Sigma-Aldrich | T5648 |
| Miglyol 812溶剂 | -- | -- | |
| 视网膜血管染色 | 异凝集素B4 | VectorLabs | -- |
| Fluoromount-G封片剂 | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| 免疫组织化学 | 抗PECAM1抗体 | BD Biosciences | 550274 |
| 抗PECAM1抗体 | Abcam | ab24590 | |
| 抗Ki67抗体 | Abcam | ab15580 | |
| 抗α-SMA抗体 | Sigma-Aldrich | F3777 | |
| 抗裂解caspase 3抗体 | Cell Signaling | 9661 | |
| 抗Hif1α抗体 | GeneTex | GTX30115 | |
| 抗CD68抗体 | serotec | MCA1957 | |
| 抗CD206抗体 | Bio-Rad | 565250 | |
| 共聚焦显微镜 | Leica | SP5 | |
| Alexa Fluor 488或594二抗 | Invitrogen | -- | |
| 组织消化 | 胶原酶II | Gibco | -- |
| 分散酶 | Gibco | -- | |
| 流式细胞术 | CD31-PE抗体 | Serotec | MCA2388PE |
| CD45-APC抗体 | eBioscience | 17-0451 | |
| CD4-PeCy7抗体 | eBioscience | 25-0041 | |
| CD8-PerCp-Cy5.5抗体 | eBioscience | 45-0081 | |
| CD45-FITC抗体 | BD | 553079 | |
| CD19-PE抗体 | eBioscience | 12-0193 | |
| Ly6G-APC抗体 | Biolegend | 127613 | |
| F4/80-APC-efluor 780抗体 | eBioscience | 47-4801 | |
| CD206-PE抗体 | AbD Serotec | MCA2235PET | |
| CD11c-FITC抗体 | BD | 557400 | |
| CCR2-APC抗体 | Biolegend | 150627 | |
| S3e细胞分选仪 | BioRad | -- | |
| FACSCanto流式细胞仪 | BD | -- | |
| 统计分析 | Prism5 | GraphPad | -- |
| Prism6 | GraphPad | -- | |
| Excel | Microsoft | -- | |
| Western blot定量 | ImageJ软件 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 内皮Gs信号体内验证 | EC-Gαs-KO小鼠基因型、他莫昔芬诱导方式、肿瘤细胞注射数量与途径 阅读提示：Materials and methods: Syngeneic tumor models; Experimental mice; Figure 1 legend |
| 体外共培养模型 | HUVEC和MLEC传代次数、siRNA转染条件、共培养细胞比例、检测时间点 阅读提示：Materials and methods: Cells; siRNA-mediated knockdown; Co-culture experiments; Figure 2 legend |
| CALCRL受体验证 | siRNA靶序列、AM22-52浓度、组织来源 阅读提示：Materials and methods: siRNA-mediated knockdown; Reagents; Figure 3 legend |
| 肾上腺髓质素来源验证 | siRNA/shRNA靶序列、敲低效率、共培养时间 阅读提示：Materials and methods: Lentiviral infection; Figure 4 legend; Figure S3 legend |
| CCL2表达调控 | CCL2处理浓度、db-cAMP处理条件、Gαs/CALCRL敲低方式 阅读提示：Materials and methods: Reagents; Figure 6 legend; Figure S4 legend |
| 体内CCL2功能验证 | EC-Ccl2-KO和EC-Gαs/Ccl2-dKO基因型、肿瘤细胞注射数量、肿瘤生长监测时间 阅读提示：Materials and methods: Experimental mice; Syngeneic tumor models; Figure 8 legend |