临床标本相关性分析
评估核β-catenin、PD-L1表达与CD8+ T细胞浸润及胶质瘤分级的关系。
对20例II级、20例III级、50例IV级胶质瘤标本进行IHC染色，评分并进行相关性分析。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
β-Catenin诱导PD-L1的转录表达以促进胶质母细胞瘤免疫逃逸
β-Catenin induces transcriptional expression of PD-L1 to promote glioblastoma immune evasion
实验完整度
高包含体外细胞实验、共培养实验、颅内小鼠模型、临床标本分析及TCGA数据，并进行了功能验证（敲低/过表达）和机制验证（ChIP、报告基因）。
主要模型
U87/EGFR胶质母细胞瘤细胞 U87/EGFRvIII胶质母细胞瘤细胞 GL261小鼠胶质瘤细胞 C57BL/6小鼠颅内移植瘤模型
重点核对
Wnt3A处理浓度为20 ng/ml EGF处理浓度为100 ng/ml MK2206处理浓度为5 µM LY294002处理浓度为20 µM 颅内注射细胞数为10^5
摘要
癌细胞中PD-L1的上调有助于肿瘤细胞逃避免疫监视。在此，我们显示Wnt配体和活化的EGFR诱导β-catenin/TCF/LEF复合物结合CD274基因启动子区域，从而诱导PD-L1表达，其中AKT激活发挥重要作用。β-Catenin缺失、AKT抑制或PTEN表达降低肿瘤细胞中PD-L1的表达，增强CD8+ T细胞的活化和肿瘤浸润，并减少肿瘤生长，同时延长小鼠生存期。临床可用的AKT抑制剂与抗PD-1抗体联合治疗可克服肿瘤免疫逃逸并显著抑制肿瘤生长。此外，在人胶质母细胞瘤标本中，AKT介导的β-catenin S552磷酸化和核β-catenin与PD-L1表达呈正相关，与CD8+ T细胞肿瘤浸润呈负相关，突出了β-catenin激活在肿瘤免疫逃逸中的临床意义。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Wnt/EGFR信号通路是否通过β-catenin调控PD-L1表达并促进胶质母细胞瘤免疫逃逸？
- 核心机制
- EGFR激活和Wnt信号通过AKT磷酸化β-catenin S552，促进β-catenin/TCF/LEF复合物结合CD274启动子，转录上调PD-L1表达，从而抑制CD8+ T细胞功能，促进肿瘤免疫逃逸。
- 主要证据
- 体外实验显示Wnt3A和EGF诱导β-catenin/TCF/LEF结合CD274启动子并上调PD-L1；小鼠颅内模型显示β-catenin缺失或AKT抑制减少PD-L1表达、增加CD8+ T细胞浸润并抑制肿瘤生长；人GBM标本中β-catenin S552磷酸化与PD-L1表达正相关，与CD8+ T细胞浸润负相关。
- 研究意义
- 为改善靶向治疗和PD-1/PD-L1阻断疗法的临床反应率和疗效提供了分子基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外验证Wnt/EGFR诱导PD-L1表达
验证Wnt配体和EGFR激活是否通过β-catenin上调PD-L1表达。
用Wnt3A或EGF处理多种肿瘤细胞，检测PD-L1 mRNA和蛋白水平；用β-catenin shRNA敲低或CA β-catenin过表达验证其必要性。
验证AKT/β-catenin通路机制
证明AKT激活通过β-catenin S552磷酸化上调PD-L1表达。
使用MK2206（AKT抑制剂）、LY294002（PI3K抑制剂）、PTEN过表达或敲低、myr-AKT1过表达，检测对β-catenin磷酸化和PD-L1表达的影响。
验证β-catenin/TCF/LEF结合CD274启动子
证明β-catenin/TCF/LEF复合物直接结合CD274启动子并增强转录。
构建CD274启动子荧光素酶报告基因（WT和突变TCF/LEF结合位点），进行ChIP实验检测β-catenin和LEF-1结合。
体外共培养验证T细胞抑制
验证肿瘤细胞PD-L1表达对T细胞活化的抑制作用。
将Wnt3A预处理的GL261或U251细胞与活化的CD8+ T细胞或Jurkat T细胞共培养，检测IL-2和IFNγ表达。
小鼠颅内移植瘤模型评估体内效果
评估β-catenin/PD-L1通路对肿瘤生长、免疫浸润和生存期的影响。
将GL261-FL细胞（不同基因修饰）颅内注射到C57BL/6小鼠，监测肿瘤生长和生存期；并进行MK2206和抗PD-1抗体治疗。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证机制链路
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | Wnt3A蛋白 | R&D Systems | 5036-WN-010 |
| 表皮生长因子 | EMD Millipore | 01-407 | |
| MK-2206 | Selleck Chemicals | S1078 | |
| LY294002 | LC Laboratories | L-7988 | |
| 细胞培养 | 佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯 | Sigma-Aldrich | P8139 |
| 离子霉素 | Sigma-Aldrich | I3909 | |
| D-荧光素 | Cayman | 14681 | |
| 转染 | HyFect转染试剂 | Denville Scientific | E2650 |
| Western blot | 抗β-catenin抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7963 |
| 抗PD-L1抗体 | Cell Signaling Technology | 13684 | |
| 抗AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 9272 | |
| 抗磷酸化AKT（T308）抗体 | Cell Signaling Technology | 4056 | |
| 抗磷酸化AKT（S473）抗体 | Cell Signaling Technology | 4060 | |
| 抗PTEN抗体 | Cell Signaling Technology | 9559 | |
| 免疫沉淀 | 抗LEF-1抗体 | Cell Signaling Technology | 76010 |
| 免疫组化 | 抗CD8α抗体 | Cell Signaling Technology | 98941 |
| 抗人CD8抗体 | Abcam | ab17147 | |
| 流式细胞术 | PD-L1 PE偶联抗体 | Thermo Fisher Scientific | 12-5983-42 |
| 动物实验 | 抗小鼠PD-1抗体 | Bio X Cell | BE0146 |
| 抗小鼠PD-L1抗体 | Bio X Cell | BE0101 | |
| ELISpot | CD4+ T细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | -- |
| CD8+ T细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | -- | |
| ELISpot试剂盒 | R&D Systems | -- | |
| ChIP | SimpleChIP酶法染色质免疫沉淀试剂盒 | Cell Signaling Technology | 9003 |
| 报告基因 | pGL3-Basic载体 | Promega | -- |
| pRL-TK载体 | Promega | -- | |
| 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | -- | |
| 转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| DMEM/F12培养基 | -- | -- | |
| 牛血清 | HyClone | -- | |
| B27添加剂 | -- | -- | |
| 碱性成纤维细胞生长因子 | -- | -- | |
| 流式细胞术 | BD FACSCelesta流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| 生物发光成像 | IVIS 100成像系统 | Xenogen | -- |
| Living Image软件 | Xenogen | -- | |
| 免疫组化 | VECTASTAIN ABC试剂盒 | Vector Laboratories | -- |
| 蛋白提取 | 裂解缓冲液 | -- | -- |
| 蛋白定量 | Image Lab软件 | Bio-Rad | -- |
| ChIP | CFX96实时荧光定量PCR检测系统 | Bio-Rad | -- |
| Western blot | 抗FLAG抗体 | Sigma-Aldrich | F3165 |
| 抗HA抗体 | Sigma-Aldrich | H6908 | |
| 抗微管蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | T6074 | |
| 抗颗粒酶B抗体 | Abcam | -- | |
| 抗活性β-catenin抗体 | Cell Signaling Technology | 8814 | |
| 抗H2-KD抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53852 | |
| 动物实验 | 抗CD8抗体（克隆2.43） | -- | -- |
| 流式细胞术 | 抗CD3e抗体 | Thermo Fisher Scientific | 145-C11 |
| 抗CD4抗体 | Thermo Fisher Scientific | GK1.5 | |
| 抗CD8抗体 | Thermo Fisher Scientific | 53-6.7 | |
| ELISpot | Histopaque-1077分离液 | Sigma-Aldrich | -- |
| 红细胞裂解液 | Beyotime | -- | |
| 药物处理 | 嘌呤霉素 | EMD Biosciences | 540222 |
| G418 | EMD Biosciences | 345810 | |
| Western blot | 正常兔免疫球蛋白 | Santa Cruz Biotechnology | sc-2027 |
| 正常小鼠免疫球蛋白 | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| 质粒构建 | QuikChange定点突变试剂盒 | Stratagene | -- |
| 动物实验 | 异氟烷 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体外细胞处理 | Wnt3A、EGF浓度和处理时间；MK2206、LY294002浓度和处理时间；血清饥饿时间。 阅读提示：Figure 1 and Figure 2 legends |
| 基因敲低/过表达 | shRNA靶序列和稳定表达细胞构建；CA β-catenin、myr-AKT1、PTEN表达质粒使用。 阅读提示：Materials and methods：DNA constructs and mutagenesis |
| 启动子报告基因和ChIP | CD274启动子片段长度和突变位点；抗体和引物序列。 阅读提示：Materials and methods：Luciferase reporter assay and ChIP assay |
| 共培养实验 | T细胞活化条件（PMA/ionomycin浓度和时间）；共培养比例和时长。 阅读提示：Materials and methods：Co-culture experiments |
| 小鼠颅内模型 | 细胞注射数量、体积、小鼠品系和性别；给药方案（MK2206和抗体剂量、途径、时间）。 阅读提示：Materials and methods：Animal experiments |
| 临床标本分析 | GBM标本来源、IHC评分标准、抗体、相关性分析方法。 阅读提示：Materials and methods：IHC analysis and scoring |
| TCGA数据分析 | 数据来源、PTEN突变定义、CD274表达标准化方法和统计检验。 阅读提示：Materials and methods：TCGA analyses |