单细胞转录组分析免疫微环境
比较非VETC和VETC HCC组织中免疫细胞和内皮细胞的组成差异。
对6例非VETC和6例VETC HCC组织进行scRNA-seq，分析127,510个单细胞，鉴定主要细胞类型和亚群。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
包裹肿瘤细胞团的血管通过塑造免疫抑制微环境促进肝细胞癌的非侵袭性转移
Vessels encapsulating tumor clusters promote noninvasive metastasis of hepatocellular carcinoma by shaping an immunosuppressive microenvironment
实验完整度
高包含scRNA-seq、IHC、多重免疫荧光、细胞-细胞相互作用分析、Treg清除小鼠实验、VETC破坏与恢复实验等多个独立证据层级，并进行功能验证和机制验证。
主要模型
人HCC组织样本（VETC与非VETC） Hepa1-6小鼠同种移植模型 LC-Rd53小鼠同种移植模型 NSG免疫缺陷小鼠模型
重点核对
人HCC样本中VETC与非VETC的判定标准 Treg清除实验：抗CD25抗体剂量、给药时间及方案 VETC破坏实验：shAngpt2或Rebastinib处理及给药方案 VETC恢复实验：重组Angpt2的剂量和给药方式
摘要
包裹肿瘤细胞团的血管（VETC）是肝细胞癌（HCC）中一种独特的血管模式，以整个细胞团的形式促进非侵袭性转移。VETC与肿瘤微环境之间的相互作用有待探索。本文中，我们发现，与人类非VETC-HCC相比，VETC肿瘤表现出更多的PD1+CD8+ T细胞和Tregs，尤其是TNFRSF4+ Tregs和Ki67+ Tregs，它们表现出增强的免疫抑制和增殖活性。这种免疫抑制状态在VETC-HCC的肿瘤栓子中也被检测到，且栓子中Treg密度与转移性细胞增殖呈正相关。VETC-HCC显示TNFRSF4+ Tregs/Ki67+ Tregs与PD1+CD8+ T细胞之间存在丰度相关性、更近的空间距离和更强的免疫抑制性配体-受体相互作用。在小鼠中清除Tregs可减少VETC同种移植物的原发灶、肿瘤栓子和转移灶中的PD1+CD8+ T细胞，并减弱同种移植物转移。VETC-HCC的内皮细胞中TGF-β1水平上调，并与TNFRSF4+ Tregs/Ki67+ Tregs富集相关。破坏VETC形成可降低内皮TGF-β1表达，并减少TNFRSF4+ Tregs、Ki67+ Tregs、PD1+CD8+ T细胞和Treg/CD8+ T细胞比率。总之，VETC可能通过TGF-β1增强Treg活性，而Tregs通过免疫抑制性配体-受体相互作用促进并维持CD8+ T细胞耗竭，从而塑造免疫抑制微环境，使肿瘤细胞团保留这种生态位以进行传播。这些发现揭示了肿瘤免疫微环境形成的机制，并为精准医疗提供了理论依据。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- VETC血管模式如何影响肝细胞癌的肿瘤免疫微环境，以及这种微环境在VETC驱动转移中的作用。
- 核心机制
- VETC内皮细胞TGF-β1上调促进Treg富集和活化，Tregs通过Galectin9-TIM3等免疫抑制配体-受体相互作用促进CD8+ T细胞耗竭，塑造免疫抑制微环境。
- 主要证据
- 人样本scRNA-seq、IHC和多重免疫荧光显示VETC肿瘤中TNFRSF4+ Tregs、Ki67+ Tregs和PD1+CD8+ T细胞增多；Treg清除减少转移；破坏VETC降低TGF-β1和免疫抑制；恢复VETC逆转这些效应。
- 研究意义
- 揭示了肿瘤免疫微环境形成的机制，并为基于血管模式的HCC精准治疗提供理论依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证免疫细胞差异及空间关系
验证VETC肿瘤中Tregs和CD8+ T细胞的数量、功能状态及空间分布。
对119例人HCC样本进行IHC和多重免疫荧光染色，检测Tregs、TNFRSF4+ Tregs、Ki67+ Tregs、PD1+CD8+ T细胞等，并进行空间距离分析。
细胞间相互作用分析
分析Tregs与CD8+ T细胞之间的配体-受体相互作用。
使用CellPhoneDB分析Treg_TNFRSF4和Treg_MKI67与CD8_PDCD1的相互作用，并验证Galectin9-TIM3轴。
Treg清除实验
验证Tregs在VETC同种移植模型转移中的作用。
在Hepa1-6同种移植模型中，用抗CD25抗体清除Tregs，评估原发灶、肿瘤栓子和转移灶的免疫细胞及转移情况。
VETC形成破坏实验
验证VETC结构是否通过TGF-β1塑造免疫抑制微环境。
通过shAngpt2或Rebastinib抑制Angpt2/Tie2信号破坏VETC，检测内皮TGF-β1表达和免疫细胞变化。
VETC形成恢复实验
验证恢复VETC能否逆转免疫抑制表型。
对Hepa-shAngpt2同种移植物进行重组Angpt2补充，检测VETC形成和免疫细胞变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证免疫效应
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Corning | 0-013-CVRC |
| 胎牛血清 | Gibco | 10099141 | |
| 单细胞悬液制备 | 脱氧核糖核酸酶I | Sigma-Aldrich | AMPD1-1KT |
| 分散酶 | Corning | 354235 | |
| II型胶原酶 | Thermo Fisher | 17101015 | |
| IV型胶原酶 | Thermo Fisher | 17104019 | |
| 红细胞裂解液 | Beyotine | C3702 | |
| 死细胞去除试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| 单细胞测序 | Chromium系统 | 10x Genomics | -- |
| NovaSeq 6000 X测序仪 | Illumina | -- | |
| 慢病毒包装 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher | L3000015 |
| Lenti-X HTX包装混合物 | Clontech | -- | |
| RNA提取和qPCR | TRIzol试剂 | Thermo Fisher | 15596026 |
| M-MLV逆转录酶 | Promega | M1701 | |
| SYBR Green qPCR预混液 | Bimake | B21202 | |
| 动物实验 | 基质胶 | R&D Systems | 3432-005-01 |
| Rebastinib | MedChemExpress | HY-13024 | |
| 重组小鼠Angpt2蛋白 | R&D Systems | 7186-AN-025 | |
| 免疫组化和免疫荧光 | OCT包埋剂 | SAKURA Finetekn | 4583 |
| Dako EnVision检测系统 | Dako Denmark A/S | K5007 | |
| 苏木素 | Leagene | DH0005 | |
| Vari Fluor 488 TSA | MedChemExpress | HY-D1837 | |
| Vari Fluor 555 TSA | MedChemExpress | HY-D1836 | |
| Vari Fluor 640 TSA | MedChemExpress | HY-D18364 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| 组织切片扫描 | Leica Aperio VERSA 200扫描仪 | Leica Biosystems | -- |
| Leica TCS SP8X共聚焦显微镜 | Leica Biosystems | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 人HCC样本收集 | 样本来源：中山大学肿瘤防治中心，2010-2022年，未接受术前治疗；VETC判定标准；样本量：119例（IHC） 阅读提示：Methods: Human tissue specimens，Results: Figure 1F-H |
| 单细胞RNA测序 | 样本量：6例非VETC和6例VETC；组织处理：酶消化和机械分离；建库平台：10x Genomics；测序平台：NovaSeq 6000 X；分析版本：Seurat 5.1.0，Cell Ranger 6.0.1 阅读提示：Methods: Preparation of single-cell suspension for scRNA-seq，scRNA-seq and data processing，Quantification of single-cell gene expression |
| Treg清除实验 | 小鼠：C57BL/6J，5周龄；细胞：Hepa1-6（6×10^5）接种于肝脏；抗CD25抗体剂量：200μg/次，第10、17、24天腹腔注射；取材时间：接种后4周 阅读提示：Methods: Mouse allograft models，Figure 5 legend |
| VETC破坏实验 | shAngpt2稳定敲低Hepa1-6；Rebastinib剂量：20mg/kg，每日一次，第10-21天；对照组：溶剂（40% PEG300, 53% saline, 5% Tween-80, 2% DMSO） 阅读提示：Methods: Mouse allograft models，Establishment of cell lines with stable knockdown of Angpt2，Figure 7 legend |
| VETC恢复实验 | 重组Angpt2剂量：0.2μg/每100mm^3肿瘤体积，瘤周注射，隔日一次，第7-15天 阅读提示：Methods: Mouse allograft models，Figure 8 legend |