Cas9-LP细胞系建立与验证
建立可追踪T谱系启动的细胞模型，并验证其生理相关性。
从Ebf1缺陷的Rosa26-Cas9敲入小鼠胎肝祖细胞中建立Cas9-LP细胞系，通过体外OP9-DLL4共培养和体内移植验证其T细胞分化潜能，并通过转录组、蛋白质组和单细胞RNA测序分析其基因表达谱。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
Notch与RUNX因子的相互作用调控T谱系程序的启动
Notch interaction with RUNX factors regulates initiation of the T-lineage program
实验完整度
高包含细胞系模型、体内移植实验、单细胞转录组、蛋白质组、ChIP-seq、CRISPR敲除和功能验证等多层级证据。
主要模型
Cas9-LP细胞系 原代骨髓造血祖细胞 Rosa26-Cas9敲入小鼠 OP9-DLL4共培养体系
重点核对
Notch刺激时间点（0、8、16、24小时及2-10天） sgRNA靶向Cbfb、Ctcf、Med12 Cbfb缺失后T特征基因表达变化 RUNX1与CTCF或Notch1-IC的相互作用 RUNX1、CTCF、Med12、p300的ChIP-seq峰
摘要
Runt相关转录因子（RUNX）在T细胞发育中发挥关键作用。在T谱系定型检查点，RUNX1经历动态的伙伴转换，导致其重新部署。在此，我们研究了RUNX因子在淋巴祖细胞（LP）和Notch刺激的最早期T祖细胞阶段（Phase 1）之间的功能差异。我们鉴定出CCCTC结合因子（CTCF）是LP特异的RUNX1相互作用伙伴，LP特异的RUNX1结合基因组位点显著富集CTCF共有基序，并与CTCF共占据。在Notch刺激下，Notch1胞内结构域直接与RUNX1相互作用，并将RUNX1/Mediator/p300转录激活复合物招募至Notch调控的T特征基因位点。通过CRISPR/Cas9介导的阶段特异性删除RUNX因子及其结合伙伴，我们发现LP中的RUNX1/CTCF复合物负调控T特征基因表达，而Phase 1中的RUNX1/Mediator/p300复合物则促进其表达。我们的发现强调了Notch介导的RUNX因子功能转换（包括蛋白复合物重组和基因组重新部署）在启动T谱系程序中的关键作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- RUNX因子在淋巴祖细胞（LP）和Notch刺激后的Phase 1细胞中如何发生功能转换，从而启动T谱系程序？
- 核心机制
- Notch刺激导致RUNX1结合伙伴从CTCF转换为Notch1-IC，从而将RUNX1/Mediator/p300复合物重定向至T特征基因位点，由抑制转为激活。
- 主要证据
- 在Cas9-LP细胞系中，通过蛋白质组学鉴定RUNX1相互作用伙伴，ChIP-seq显示RUNX1结合位点转换，CRISPR敲除Cbfb、Ctcf、Med12后检测T特征基因表达和DN2分化。
- 研究意义
- 揭示了Notch介导的RUNX因子功能转换在启动T谱系程序中的关键作用，并提示了保守的调控机制。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
RUNX1结合位点的阶段特异性分析
比较LP和Phase 1细胞中RUNX1的基因组结合差异。
对LP和Phase 1细胞进行RUNX1 ChIP-seq，鉴定LP特异和Phase 1特异的结合峰，并进行基序分析。
RUNX1相互作用蛋白的鉴定
识别LP和Phase 1阶段RUNX1的差异相互作用伙伴。
使用Myc-FLAG-RUNX1-ERT2进行两步亲和纯化，结合质谱分析，鉴定RUNX1相互作用蛋白，并用免疫共沉淀验证。
功能验证：RUNX、CTCF和Med12的缺失效应
确定RUNX/CTCF和RUNX/Mediator复合物在LP和Phase 1中的功能。
通过CRISPR/Cas9介导的Cbfb、Ctcf或Med12缺失，检测LP中是否自发产生CD25+细胞，以及Phase 1中DN2分化是否受损。
染色质结合分析验证复合物靶向
验证RUNX1/CTCF和RUNX1/Mediator复合物在靶基因位点的结合。
对LP和Phase 1细胞进行CTCF、Med12、p300、Notch1-IC的ChIP-seq，分析它们与RUNX1峰的共定位，并检测靶基因表达变化。
原代骨髓祖细胞验证
在生理相关细胞中验证RUNX/CTCF和RUNX/Mediator的功能。
从Cas9;Bcl2 Tg小鼠分离骨髓祖细胞，转导sgRNA后与OP9或OP9-DLL1共培养，检测B细胞和T细胞分化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Iscove改良Dulbecco培养基 | Wako | 098-06465 |
| 胎牛血清 | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| 青霉素-链霉素-谷氨酰胺 | Gibco | 10378-016 | |
| β-巯基乙醇 | Sigma-Aldrich | 21985-023 | |
| 小鼠干细胞因子 | PeproTech | 250-03 | |
| 人Fms样酪氨酸激酶3配体 | PeproTech | 300-19 | |
| 人白细胞介素-7 | PeproTech | 200-07 | |
| α-MEM培养基 | Wako | 137-17215 | |
| 分子实验 | 4-羟基他莫昔芬 | Sigma-Aldrich | T2859 |
| 免疫共沉淀 | 抗FLAG M2琼脂糖 | Sigma-Aldrich | A2220 |
| 3×FLAG肽 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 抗Myc磁珠 | MBL | -- | |
| 蛋白质质谱 | 胰蛋白酶 | -- | -- |
| Advance超高效液相色谱仪 | Bruker | -- | |
| Orbitrap Velos Pro质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 免疫印迹 | 抗-tubulin-α抗体 | Sigma-Aldrich | T6199 |
| 抗lamin B抗体 | CST | 13435 | |
| 抗Myc抗体 | MBL | M192-3 | |
| 抗FLAG抗体 | Sigma-Aldrich | F3165 | |
| 抗Cbfb抗体 | CST | 62184 | |
| 抗CTCF抗体 | CST | 3418 | |
| 抗Med12抗体 | Bethyl | A300-774A | |
| 抗Notch1-IC抗体 | CST | 4147 | |
| ChIP-seq | 双琥珀酰亚胺戊二酸酯 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 甲醛 | -- | -- | |
| Bioruptor超声波破碎仪 | Diagenode | -- | |
| 抗RUNX1抗体 | Abcam | ab23980 | |
| 抗p300抗体 | CST | 57625 | |
| 包被抗兔IgG的Dynabeads | -- | -- | |
| ChIP DNA纯化浓缩试剂盒 | Zymo | D5205 | |
| NEBNext Ultra II DNA文库制备试剂盒 | NEB | E7645S | |
| 用于Illumina的NEBNext多重寡核苷酸 | NEB | E6440S | |
| RNA-seq | RNeasy Micro试剂盒 | Qiagen | 74004 |
| QuantSeq 3' mRNA-seq文库制备试剂盒FWD | LEXOGEN | -- | |
| D1000高灵敏度TapeStation | Agilent Technologies | -- | |
| scRNA-seq | 10x Genomics Chromium Next GEM单细胞3'试剂盒 | 10x Genomics | -- |
| Dynabeads MyOne硅烷磁珠 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| SPRIselect磁珠 | Beckman Coulter | -- | |
| 流式细胞术 | FACSLyric流式细胞仪 | BD | -- |
| FACSAria流式细胞仪 | BD | -- | |
| FACSAria Fusion流式细胞仪 | BD | -- | |
| LSRFortessa流式细胞仪 | BD | -- | |
| CD45-PECy7抗体 | BioLegend | 103113 | |
| CD44-FITC抗体 | BioLegend | 103005 | |
| CD25-APC-e780抗体 | eBioscience | 47-0251-82 | |
| 人NGFR-PE抗体 | BioLegend | 345106 | |
| CD19-APC抗体 | eBioscience | 17-0193-80 | |
| 生物素标记的谱系抗体混合物 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | Cas9-LP细胞系建立方法、培养基成分、细胞因子浓度 阅读提示：Materials and methods: Cell culture of Cas9-LP cell lines |
| Notch刺激 | Notch刺激时间点（0、8、16、24小时及2-10天） 阅读提示：Results: scRNA-seq reveals transcriptional dynamics of Notch-stimulated LPs; Figure 1 |
| 基因敲除 | sgRNA序列、转导时间、缺失效率验证 阅读提示：Materials and methods: CRISPR/Cas9-mediated deletion of target genes in LPs; Figure S3A |
| ChIP-seq | 细胞数量、交联条件、抗体、峰鉴定参数 阅读提示：Materials and methods: ChIP-seq |
| 原代骨髓祖细胞实验 | 小鼠品系、骨髓细胞分离、共培养时间 阅读提示：Results: Effects of RUNX, CTCF, or Med12 deletion on DN2 cell generation in primary BM progenitors; Figure 8 |