单细胞转录组图谱构建
描绘人类淋巴结和淋巴瘤中非造血细胞的转录组图谱。
对9例无转移淋巴结（MFLN）和10例滤泡性淋巴瘤（FL）样本进行单细胞RNA测序，整合数据并聚类，鉴定主要细胞类型和亚簇。
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人类淋巴结和淋巴瘤中非造血细胞的单细胞图谱揭示基质量塑的景观
A single-cell atlas of non-haematopoietic cells in human lymph nodes and lymphoma reveals a landscape of stromal remodelling
实验完整度
高包含scRNA-seq图谱构建、体外功能实验（CD70-CD27结合与粘附）、患者样本及预后分析等独立证据层级。
主要模型
来自9名肿瘤患者的无转移性淋巴结样本 来自10名滤泡性淋巴瘤患者的淋巴结样本 滤泡性淋巴瘤恶性B细胞 外周T细胞淋巴瘤及转化型弥漫大B细胞淋巴瘤样本
重点核对
CD70-Fc蛋白与恶性B细胞结合的阻断效率（抗CD27抗体，n=4） 抗CD27抗体对恶性B细胞在FL髓质区粘附的抑制效果（n=3） FL中LY6H、LOX、TDO2、REM1表达水平与患者总生存期的相关性（n=180） scRNA-seq中恶性B细胞的鉴定方法（轻链限制）
摘要
非造血细胞（NHCs），包括间充质基质细胞和内皮细胞，在淋巴瘤中的活性被认为构成淋巴瘤发生的基础。然而，我们对淋巴瘤NHCs的理解一直受到不明原因的NHC异质性的阻碍，即使在正常人类淋巴结（LNs）中也是如此。在这里，我们构建了一个包含从27个人类样本中收集的超过100,000个NHCs的单细胞转录组图谱，包括LNs和多种结节性淋巴瘤，并揭示了30个不同的亚簇，包括一些以前未被识别的。值得注意的是，该图谱有助于与淋巴瘤NHCs进行比较分析，揭示了滤泡性淋巴瘤NHCs中基因表达及与恶性细胞相互作用的亚簇特异性改变的意外景观。这有助于我们理解淋巴瘤中的基质重塑，并突出了潜在的临床生物标志物。我们的研究在很大程度上更新了人类LNs中的NHC分类学和疾病状态分析，并提供了一个丰富的资源和更深入的见解，以推动淋巴瘤的管理和治疗。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 人类淋巴结和淋巴瘤中非造血细胞的异质性及其在淋巴瘤发生中的作用。
- 核心机制
- 滤泡性淋巴瘤中，髓质网状细胞、滤泡树突状细胞等基质细胞通过上调CXCL13、CD70等分子，促进恶性B细胞的归巢和粘附。
- 主要证据
- scRNA-seq揭示30个NHC亚簇，其中滤泡性淋巴瘤中FDC和MRC比例增加，且CD70在基质细胞上高表达。功能实验证实CD70与恶性B细胞结合可被抗CD27抗体阻断，且阻断后粘附减少。
- 研究意义
- 为理解淋巴瘤基质重塑提供资源和见解，提出CD70等基质来源的潜在预后标志物和治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
亚簇鉴定与特征分析
揭示主要NHC组分内部的异质性。
对BEC、LEC、NESC分别进行无监督聚类，鉴定亚簇，并分析标记基因和差异表达基因。
FL与MFLN的差异分析
比较滤泡性淋巴瘤与正常淋巴结的NHC组成和转录差异。
比较FL和MFLN中各NHC亚簇的比例和基因表达，鉴定FL特异性的变化。
细胞间相互作用分析
分析NHC亚簇与恶性B细胞间的配体-受体相互作用。
使用CellPhoneDB分析FL NHC和恶性B细胞间的相互作用，并筛选在FL中上调的互作。
CD70-CD27互作功能验证
验证基质来源的CD70与恶性B细胞上CD27的相互作用。
通过免疫荧光、流式细胞术、重组蛋白结合实验和离体细胞粘附实验验证CD70-CD27互作及其功能。
预后标志物分析
评估NHC亚簇特异基因与滤泡性淋巴瘤患者生存的关系。
利用公开的FL患者微阵列数据集（n=180），进行Kaplan-Meier分析和多因素Cox回归，鉴定预后相关基因。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 样本消化 | 胶原酶P | Sigma-Aldrich | 11213857001 |
| 分散酶 | Gibco | 17105041 | |
| DNase I | Worthington | LS002139 | |
| 细胞分选 | CD45磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-045-801 |
| CD235a磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-050-501 | |
| 流式染色 | PE抗人CD45抗体 | BioLegend | -- |
| 测序文库制备 | Chromium单细胞3'试剂盒（V3） | 10X Genomics | -- |
| 测序文库定量 | KAPA文库定量试剂盒 | Kapa Biosystems | KK4873 |
| 测序文库质检 | 2100生物分析仪高灵敏度DNA试剂盒 | Agilent | 5067-4626 |
| 免疫荧光 | TrueVIEW自发荧光淬灭试剂盒 | Vector | SP-8500 |
| 含DAPI封片剂 | Vector | H-1200 | |
| 重组蛋白结合实验 | 重组Fc嵌合CD70 | SinoBiological | 10780-H01H |
| 人IgG | R&D systems | 1-001-A | |
| 抗CD27阻断抗体 | R&D systems | MAB382 | |
| 小鼠IgG1同型对照 | R&D systems | MAB002 | |
| 细胞粘附实验 | EasySep释放型人CD19阳性分选试剂盒 | StemCell Technologies | ST-17754 |
| 全外显子测序 | SureSelect人类全外显子v.7试剂盒 | Agilent Technologies | 5191-4004 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 单细胞测序样本处理 | 样本消化条件：胶原酶P浓度为0.2 mg/ml，dispase 0.8 mg/ml，DNase I 0.1 mg/ml，消化1小时 阅读提示：Methods: Single-cell isolation of LNNHCs |
| 单细胞测序数据预处理 | 质量控制参数：细胞至少表达200个基因，线粒体基因比例低于中位数的两倍 阅读提示：Methods: Data processing and cell clustering of individual cases |
| 配体-受体相互作用分析 | CellPhoneDB参数：基因表达阈值>20%细胞，1000次置换 阅读提示：Methods: Intercellular ligand–receptor interaction analysis |
| 重组蛋白结合实验 | CD70-Fc蛋白浓度（未明确），孵育时间（10分钟，4°C），抗CD27抗体阻断浓度（未明确） 阅读提示：Methods: Recombinant protein binding assay |
| 离体细胞粘附实验 | 细胞数量（2×10^6），旋转孵育（60 r.p.m. 5分钟，共3次），阻断抗体处理时间（30分钟，4°C） 阅读提示：Methods: Ex vivo cell adhesion assay |
| 预后分析 | 候选基因表达阈值通过最大选择秩统计确定，数据集为GSE16131 (n=180) 阅读提示：Methods: Prognostic analysis of stroma-derived markers in FL |