建立PS-NP暴露的AD小鼠模型
评估PS-NP暴露对AD小鼠认知功能的影响
对2月龄雄性APP/PS1小鼠进行90天灌胃PS-NPs（0.25或25 mg/kg体重）或纯水，随后进行行为学测试和组织学分析。
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纳米塑料触发胶质-神经元胶原信号通讯失调以加重阿尔茨海默病的认知损伤
Nanoplastics trigger glial-neuronal collagen signaling miscommunication to exacerbate cognitive impairment in Alzheimer's disease
实验完整度
高包含体内动物模型（APP/PS1小鼠）、体外三培养细胞模型、细胞类型分辨蛋白质组学、单核转录组分析及功能验证（siRNA、药理抑制），多层次验证机制。
主要模型
APP/PS1小鼠（C57BL/6J背景） 星形胶质细胞-小胶质细胞-神经元三培养体系（SVG p12、HMC3、RA-SH-SY5Y） 人类AD脑组织单核转录组数据（GSE188545）
重点核对
PS-NPs剂量：0.25、25 mg/kg体重，灌胃90天 TC-I 15给药剂量：10 µg/只，隔日腹腔注射 三培养体系中PS-NPs浓度：0、2、10、50 µg/mL处理48小时 si-COL1A1转染浓度：30 nM 动物性别和月龄：雄性APP/PS1小鼠，2月龄
摘要
引言：阿尔茨海默病（AD）是一种进行性神经退行性疾病，治疗方法有限且环境风险因素不明。微塑料和纳米塑料（MNPs）是广泛存在的污染物，与神经毒性有关，但它们在AD中的作用仍不清楚。方法：我们研究了90天灌胃暴露聚苯乙烯纳米塑料（PS-NPs）对淀粉样前体蛋白/早老素1（APP/PS1）小鼠的影响，采用行为测试、脑成像、组织病理学和细胞类型分辨蛋白质组学。结果：PS-NPs加重了APP/PS1小鼠的认知缺陷和海马损伤。蛋白质组学和CellChat分析显示，PS-NPs通过胶原-整合素轴增强了神经胶质通讯。体外三培养表明，PS-NPs增强了胶原介导的星形胶质细胞-小胶质细胞-神经元信号传导，而体内阻断TC-I 15抑制了胶原激活并改善了PS-NP暴露的APP/PS1小鼠的认知。人类AD脑的单核RNA测序验证了胶原信号传导的保守激活。讨论：我们的发现强调，PS-NPs通过驱动胶原依赖性神经胶质功能障碍加剧了AD的认知损伤，将MNPs确立为可改变的环境风险因素。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 环境微纳米塑料暴露是否通过影响脑内细胞间通讯加剧阿尔茨海默病相关的认知障碍？
- 核心机制
- PS-NPs通过增强星形胶质细胞来源的COL1A1与小胶质细胞上整合素ITGA1/ITGB1的结合，激活小胶质细胞；进而小胶质细胞来源的COL1A2与神经元上ITGA1/ITGB1结合，促进Aβ诱导的p38 MAPK磷酸化，导致神经元死亡，从而加重认知损伤。
- 主要证据
- 在APP/PS1小鼠中，PS-NPs暴露加重认知缺陷和海马损伤，细胞类型分辨蛋白质组学和CellChat分析显示胶原信号通路增强；体外三培养模型证实COL1A1-ITGA1/ITGB1和COL1A2-ITGA1/ITGB1相互作用增强，并导致小胶质细胞M1极化和神经元死亡；siRNA敲低或TC-I 15阻断该通路可减轻神经毒性；人类AD脑snRNA-seq数据进一步验证胶原信号上调。
- 研究意义
- 该研究将塑料污染确立为痴呆的可改变环境风险因素，为缓解污染加重认知衰退提供了潜在干预靶点（如胶原介导的神经胶质功能障碍）。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细胞类型分辨蛋白质组学与细胞通讯分析
鉴定PS-NP暴露后海马各细胞类型间的通讯变化
分离海马星形胶质细胞、小胶质细胞、神经元和少突胶质细胞，进行无标记定量蛋白质组学分析，利用CellChat分析细胞间通讯网络。
体外三培养模型验证胶原信号通路
验证PS-NPs是否通过胶原-整合素轴增强细胞间通讯
建立星形胶质细胞（SVG p12）、小胶质细胞（HMC3）和神经元（RA-SH-SY5Y）的三培养系统，PS-NP处理后检测COL1A1/COL1A2与整合素的结合、小胶质细胞极化、Aβ水平、p38 MAPK活化和神经元死亡。
功能干预验证胶原信号通路
验证阻断胶原信号是否能逆转PS-NP诱导的神经毒性
在三培养系统中通过siRNA敲低COL1A1或使用TC-I 15抑制整合素，检测下游效应；并在体内对PS-NP暴露的APP/PS1小鼠给予TC-I 15治疗。
人类AD脑组织单核转录组验证
验证胶原信号通路在人类AD中的保守性
分析人类AD患者和健康对照的snRNA-seq数据（GSE188545），比较细胞间通讯和胶原信号通路活性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | 聚苯乙烯纳米塑料 | Magsphere Inc. | PS050NM |
| 荧光聚苯乙烯纳米塑料 | Magsphere Inc. | PSYF050NM | |
| 药理干预 | TC-I 15 | MedChemExpress | 916734-43-5 |
| 动物灌注与固定 | 磷酸盐缓冲液 | Servicebio | G0002 |
| 行为测试 | Y迷宫装置 | -- | -- |
| 旷场箱 | Flyde | -- | |
| MRI | Bruker 7T磁共振成像仪 | Bruker | -- |
| 小鼠头部低温线圈 | Bruker | -- | |
| ParaVision 360 | Bruker | -- | |
| 行为测试 | 迷宫视频追踪系统 | Chucai Electronic Technology Co. | -- |
| 图像分析 | ezTrack位置追踪模块 | -- | -- |
| ImageJ | NIH | -- | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Sigma-Aldrich | D6429 |
| 胎牛血清 | Gibco | 10099141C | |
| 青霉素-链霉素 | Meilunbio | MA0110 | |
| 视黄酸 | -- | -- | |
| Transwell聚碳酸酯膜插入物 | BIOFIL | TCP001006 | |
| 一步法快速颜色支原体检测试剂盒 | Yise Medical Technology | MD001 | |
| 细胞系 | SVG p12 | ATCC | CRL-8621 |
| HMC3 | Procell | CL_0620 | |
| SH-SY5Y | Procell | CL_0208 | |
| siRNA转染 | RNAFit | HanBio | HB-RF-1000 |
| 细胞分选 | TrypLE Select胰蛋白酶 | Gibco | 12563029 |
| 70微米细胞过滤器 | SORFA | SCS701 | |
| MACS BSA储备液 | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| 抗髓鞘磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-104-262 | |
| LS分离柱 | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MidiMACS分离器 | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| MACS神经元分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-115-389 | |
| MACS CD11b+磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-093-634 | |
| MACS ACSA-2磁珠试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-097-678 | |
| 蛋白质组学 | IP裂解缓冲液 | Beyotime | P0013 |
| 磷酸酶抑制剂混合物 | Keygen | KGB5101-100 | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Keygen | KGB5101-2 | |
| 3 kDa分子量截留装置 | Millipore | UFC5003 | |
| 二硫苏糖醇 | -- | -- | |
| 胰蛋白酶 | Thermo Fisher Scientific | 90057 | |
| Pierce肽脱盐离心柱 | Thermo Fisher Scientific | 89851 | |
| Orbitrap Exploris 480质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| C18捕集柱 | Thermo Fisher Scientific | 164535 | |
| Acclaim PepMap C18分析柱 | Thermo Fisher Scientific | 164941 | |
| Proteome Discoverer 2.1 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| UHPLC-HRMS | Vanquish超高效液相色谱系统 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱 | Waters | 176001608 | |
| Q-Exactive HFX质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Western blot | 增强型BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P0009 |
| CO-IP | Protein A/G磁珠 | Solarbio | M2400 |
| Western blot | 增强化学发光试剂盒 | Millipore | WBKLS0500 |
| Tanon-5200化学发光成像系统 | Tanon | -- | |
| ELISA | 人特异性Aβ40 ELISA试剂盒 | ELK Biotechnology | ELK8921 |
| 人特异性Aβ42 ELISA试剂盒 | ELK Biotechnology | ELK8920 | |
| 酶标仪 | Tecan Spark | -- | |
| RT-qPCR | Trizol试剂 | Accurate Biology | AG21101 |
| Nanodrop 2000分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| HiScript II Q RT SuperMix逆转录试剂盒 | Vazyme | R323-01 | |
| SYBR Green实时PCR预混液 | Accurate Biology | AG11718 | |
| Applied Biosystems ViiA 7实时荧光定量PCR仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 流式细胞术 | CD206-APC抗体 | Proteintech | APC-65155 |
| CD86-PE抗体 | Biogems | 08911-60 | |
| Accuri C6流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| FITC Annexin V凋亡检测试剂盒（含PI） | Elabscience | E-CK-A151 | |
| 动物组织消化 | 蛋白酶K | Vetec | V900887 |
| 十二烷基硫酸钠 | Biosharp | BS088 | |
| 磷酸氢二钠 | Guangzhou Chemical Reagent Factory | BG06 | |
| 磷酸二氢钠 | Guangzhou Chemical Reagent Factory | BG05 | |
| 组织染色 | 尼氏染色液 | Servicebio | GP1043 |
| Permount封片剂 | Servicebio | WG10004160 | |
| 二氢乙啶 | Sigma-Aldrich | D7008-10 | |
| DAPI | Servicebio | G1407-25ML | |
| Tris缓冲盐溶液（含吐温） | Servicebio | G0004 | |
| 免疫荧光 | 柠檬酸抗原修复液 | Servicebio | G1202 |
| 组织笔 | Servicebio | G6100 | |
| 3%牛血清白蛋白 | Servicebio | GC305006 | |
| HRP标记二抗 | Servicebio | G3431-200UL | |
| 酪胺信号放大试剂 | Servicebio | G1255 | |
| DAPI（免疫荧光用） | Servicebio | G1012 | |
| 自发荧光淬灭剂 | Servicebio | G1221 | |
| 抗荧光淬灭封片剂 | Servicebio | G1401 | |
| 摆摇床 | Servicebio | SYC-Z100 | |
| 避光湿盒 | Servicebio | SIB-20F | |
| 透射电镜 | 透射电镜固定液 | Servicebio | G1102-100ML |
| 醋酸铀 | -- | -- | |
| 柠檬酸铅 | -- | -- | |
| Formvar膜铜网 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物暴露 | 模型：APP/PS1小鼠；性别：雄性；年龄：2月龄；暴露途径：灌胃；剂量：0.25、25 mg/kg体重；周期：90天；对照组：纯水 阅读提示：参考文献：2.1节动物研究 |
| 行为测试 | 测试方法：Y迷宫、旷场、新物体识别；训练天数：5天；测试时长：5分钟；间隔时间：1小时 阅读提示：参考文献：2.4-2.6节及图1图注 |
| 体外三培养 | 细胞系：SVG p12、HMC3、RA-SH-SY5Y；PS-NP浓度：0、2、10、50 µg/mL；处理时间：48小时；三培养顺序和细胞数量 阅读提示：参考文献：2.2节细胞培养和处理 |
| 药理干预 | TC-I 15剂量：体外2 µM，体内10 µg/只；给药途径：腹腔注射；频率：隔日；时长：90天 阅读提示：参考文献：2.1节及2.2节 |
| 分子检测 | 抗体信息（COL1A1、COL1A2、ITGA1、ITGB1）详细清单见表S1；ELISA试剂盒：ELK Biotechnology，Aβ40 Cat#ELK8921、Aβ42 Cat#ELK8920 阅读提示：参考文献：2.16节和2.17节及表S1 |