RNA-seq 剪接分析识别 UNC13A 隐蔽外显子
发现受 TDP-43 调控的潜在隐蔽外显子事件
对来自 FTD-ALS 患者的 TDP-43 阳性和阴性神经元核进行 RNA-seq，并使用 MAJIQ 和 LeafCutter 进行剪接分析，识别差异剪接事件。
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TDP-43 抑制 FTD-ALS 基因 UNC13A 中的隐蔽外显子包含
TDP-43 represses cryptic exon inclusion in the FTD-ALS gene UNC13A
实验完整度
高包括 RNA-seq 分析、细胞模型（SH-SY5Y、iPSC-MNs、i3Ns）、患者脑组织检测、迷你基因报告实验、EMSA 和生存分析等多层级验证。
主要模型
SH-SY5Y 细胞系 iPSC 来源运动神经元（iPSC-MNs） iPSC 来源兴奋性神经元（i3Ns） FTLD-TDP 患者脑组织 TDP-43 敲除 HEK 293T 细胞
重点核对
TDP-43 缺失后 UNC13A 隐蔽外显子包含水平 UNC13A 风险单倍型对隐蔽外显子包含的影响 TDP-43 对 UNC13A 内含子 20-21 的结合亲和力 FTLD-TDP 患者中风险单倍型与生存期的关联
摘要
神经退行性疾病肌萎缩侧索硬化症（ALS）和额颞叶痴呆（FTD）的一个标志性病理特征是 RNA 结合蛋白 TDP-43 从脑和脊髓神经元细胞核中耗竭。TDP-43 的一个主要功能是作为 RNA 剪接过程中隐蔽外显子包含的抑制因子。人类全基因组关联研究中，UNC13A 的单核苷酸多态性与 FTD 和 ALS 的关联是最显著的信号之一，但这些变异如何增加疾病风险尚不清楚。在这里，我们显示 TDP-43 抑制 UNC13A 中的隐蔽外显子剪接事件。在人类大脑、神经元细胞系和诱导多能干细胞来源的运动神经元中，TDP-43 从细胞核中缺失导致 UNC13A mRNA 中包含隐蔽外显子，并减少 UNC13A 蛋白表达。与 FTD 或 ALS 风险相关的主要变异位于含有隐蔽外显子的内含子中，我们显示它们在 TDP-43 功能障碍的情况下增加 UNC13A 隐蔽外显子剪接。总之，我们的数据在 FTD 和 ALS 最强的遗传风险因素之一（UNC13A 遗传变异）与 TDP-43 功能丧失之间提供了直接的功能联系。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- UNC13A 的遗传变异如何与 FTD 和 ALS 风险相关，以及 TDP-43 功能障碍是否参与其中？
- 核心机制
- TDP-43 抑制 UNC13A 内含子 20-21 中的隐蔽外显子剪接，其缺失导致隐蔽外显子包含和 UNC13A 蛋白减少；风险单倍型增强此效应。
- 主要证据
- 在 RNA-seq、细胞模型、患者脑组织和迷你基因报告中，TDP-43 缺失导致隐蔽外显子包含，风险变异增强此效应；EMSA 显示风险等位基因降低 TDP-43 结合；患者生存分析显示风险单倍型与较短生存期相关。
- 研究意义
- 建立 UNC13A 遗传变异与 TDP-43 功能丧失的直接功能联系，为 ALS 和 FTD 的机制研究和潜在治疗靶点提供新方向。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细胞模型验证 TDP-43 缺失导致隐蔽外显子包含
验证 TDP-43 缺失是否导致 UNC13A 隐蔽外显子包含和蛋白减少
使用 shRNA 或 CRISPRi 在 SH-SY5Y、iPSC-MNs 和 i3Ns 中敲低 TDP-43，通过 RT-qPCR/RT-PCR 检测隐蔽外显子包含，免疫印迹检测 UNC13A 蛋白水平，并测序确认隐蔽外显子序列。
患者脑组织验证隐蔽外显子包含与病理关联
确认 UNC13A 隐蔽外显子包含在 TDP-43 蛋白病中发生并与病理相关
使用 RT-qPCR 检测 117 例额叶皮层样本（Mayo Clinic）和 NYGC 队列 RNA-seq 数据，以及 BaseScope 原位杂交检测患者脑组织切片中隐蔽外显子包含，并分析与 pTDP-43 水平的相关性。
遗传变异分析显示风险单倍型增强隐蔽外显子包含
测试 FTD-ALS 风险单倍型是否影响隐蔽外显子包含
分析 rs12973192 和 rs12608932 基因型与隐蔽外显子包含的关系，进行等位基因不平衡分析，以及构建迷你基因报告基因在 TDP-43 敲除细胞中测试风险变异对剪接的影响。
患者生存分析
评估风险单倍型是否与 FTLD-TDP 患者生存期相关
使用 Mayo Clinic 205 例 FTLD-TDP 患者的生存数据，采用 Cox 多变量模型，调整遗传突变、性别和发病年龄，分析风险单倍型对生存期的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
RNA-seq 分析
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 基质胶 | Corning | -- |
| mTeSR1培养基 | StemCell Technologies | -- | |
| ReLeSR | StemCell Technologies | -- | |
| DMEM/F12培养基 | Thermo Scientific | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| DMEM培养基 | Gibco | 10564011 | |
| L-谷氨酰胺 | Gemini Biosciences | -- | |
| MEM非必需氨基酸 | Gibco | -- | |
| 神经基础培养基 | Thermo Fisher | -- | |
| N2添加剂 | Thermo Fisher | -- | |
| B-27添加剂（无异源成分） | Thermo Fisher | -- | |
| LDN193189 | -- | -- | |
| SB-431542 | -- | -- | |
| Chir99021 | -- | -- | |
| 视黄酸 | -- | -- | |
| Smo激动剂 | -- | -- | |
| DAPT | -- | -- | |
| 木瓜蛋白酶 | Worthington Biochemical | -- | |
| 脱氧核糖核酸酶 | Worthington Biochemical | -- | |
| 多聚-D-赖氨酸/层粘连蛋白 | -- | -- | |
| 脑源性神经营养因子 | R&D Systems | -- | |
| 胶质细胞源性神经营养因子 | R&D Systems | -- | |
| 睫状神经营养因子 | R&D Systems | -- | |
| Opti-MEM I减血清培养基 | Gibco | -- | |
| siLentfect转染试剂 | Bio-Rad | -- | |
| TRIzol试剂 | Zymo Research | -- | |
| shRNA敲低 | 短发夹RNA | -- | -- |
| 慢病毒包装质粒 (psPAX2, pMD2.G) | Cellecta | -- | |
| Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| Lenti-X 293T细胞 | Takara | -- | |
| Lenti-X浓缩器 | Takara | -- | |
| 免疫印迹 | RIPA裂解液 | Sigma-Aldrich | R0278 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Thermo Fisher | 78429 | |
| 磷酸酶抑制剂 | Thermo Fisher | 78426 | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Invitrogen | 23225 | |
| LDS样品缓冲液 | Invitrogen | NP0008 | |
| 4-12% Bis-Tris凝胶 | Thermo Fisher | NP0335BOX | |
| 0.45μm硝酸纤维素膜 | Bio-Rad | 162-0115 | |
| Odyssey封闭液 | LiCOr | 927-40010 | |
| UNC13A抗体 | Proteintech | 55053-1-AP | |
| TDP-43抗体 | Abnova | H00023435-M01 | |
| GAPDH抗体 | Cell Signaling Technologies | 5174S | |
| HRP标记的抗小鼠IgG | Fisher | 62-6520 | |
| HRP标记的抗兔IgG | Life Technologies | 31462 | |
| ECL Prime化学发光试剂盒 | Invitrogen | -- | |
| ChemiDox XRS+成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| RNA提取与逆转录 | RNeasy Micro试剂盒 | Qiagen | -- |
| QIAshredder柱 | Qiagen | -- | |
| SuperScript IV VILO预混液 | Thermo Scientific | -- | |
| qPCR | PowerTrack SYBR Green预混液 | Thermo Scientific | -- |
| QuantStudio 6 Flex荧光定量PCR仪 | Thermo Scientific | -- | |
| PCR | NEBNext Ultra II Q5预混液 | New England Biolabs | -- |
| RNA提取与逆转录 | High-Capacity cDNA逆转录试剂盒 | Invitrogen | -- |
| qPCR | SYBR GreenER qPCR预混液 | Invitrogen | -- |
| QuantStudio 7 Flex实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| 细胞培养 | 基质胶 | Fisher Scientific | CB-40230 |
| mTeSR1培养基 | Stemcell Technologies | 85850 | |
| shRNA敲低 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 慢病毒包装 | 第三代包装质粒 (pMDLg/pRRE, pRSV-Rev, pMD2.G) | -- | -- |
| 扩增子测序 | Wizard SV凝胶和PCR纯化系统 | Promega | -- |
| 扩增子EZ测序服务 | Genewiz | -- | |
| 原位杂交 | BaseScope红色检测试剂盒 | ACDBIO | -- |
| LED植物生长灯 | HTG Supply | LED-6B240 | |
| TSA Plus-Cy3荧光试剂 | Akoya Biosciences | -- | |
| TDP-43抗体 | Proteintech | 10782-2-AP | |
| NeuN抗体 | Synaptic Systems | 266004 | |
| DAPI | Life Technologies | -- | |
| Leica SP8共聚焦显微镜 | Leica | -- | |
| 基因分型 | Wizard基因组DNA纯化试剂盒 | Promega | -- |
| TaqMan SNP基因分型检测 | Thermo Fisher Scientific | 4351379 | |
| 剪接报告实验 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| PureLink RNA小提试剂盒 | Life Technologies | -- | |
| PureLink DNase | Invitrogen | -- | |
| High Capacity cDNA逆转录试剂盒 | Invitrogen | -- | |
| OneTaq 2X预混液（标准缓冲液） | NEB | -- | |
| Mastercycler Pro热循环仪 | Eppendorf | -- | |
| 定点突变试剂盒 | New England Biolabs | E0554S | |
| pTB UNC13A微型基因构建 | -- | -- | |
| 绿色荧光蛋白 | -- | -- | |
| GFP-TDP-43融合蛋白 | -- | -- | |
| GFP-TDP-43 5FL突变体 | -- | -- | |
| AllStars阴性对照siRNA | Qiagen | -- | |
| 靶向TARDBP 3'非翻译区的siRNA | Qiagen | -- | |
| 体外结合实验 | TDP43-MBP-His6质粒 | Addgene | 104480 |
| 大肠杆菌One Shot BL21 Star (DE3)细胞 | ThermoFisher | -- | |
| 异丙基硫代半乳糖苷 | -- | -- | |
| cOmplete无EDTA蛋白酶抑制剂片 | Roche | -- | |
| Ni-NTA琼脂糖珠 | Qiagen | -- | |
| Amicon Ultra-15离心过滤器，截留分子量50 kDa | Millipore | -- | |
| XK 50/20柱 | Cytiva | -- | |
| 26/600 Superdex 200 pg柱 | Cytiva | -- | |
| 电泳迁移率变动分析 | -- | -- | |
| Cy5标记RNA | -- | -- | |
| Typhoon扫描仪 | -- | -- | |
| 数据分析 | GraphPad Prism | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| RNA-seq剪接分析 | 样本类型（神经元核），患者数量（7例），MAJIQ和LeafCutter参数，以及ΔΨ阈值。 阅读提示：Methods: RNA-seq alignment and splicing analysis; Fig. 1a, b |
| 细胞敲低实验 | 细胞系（SH-SY5Y, iPSC-MNs, i3Ns），shRNA序列，敲低时间（6天或7天），检测方法（RT-qPCR, RT-PCR,免疫印迹），归一化基因（RPLP0, GAPDH）。 阅读提示：Methods: Cell culture, shRNA cloning, lentiviral packaging, and cellular transduction; Fig. 1c-h; Extended Data Fig. 3 |
| 患者样本检测 | 脑区（额叶皮层），样本数量（Mayo Clinic: 117; NYGC: 1151），诊断标准（FTLD-TDP等），RT-qPCR引物，RNA-seq数据处理。 阅读提示：Methods: Post-mortem brain tissues for detecting UNC13A splice variant; Quantification of UNC13A splice variants in bulk RNA sequencing; Fig. 2 |
| 遗传变异分析 | SNP rs12608932, rs12973192, rs56041637的基因型，连锁不平衡计算，迷你基因报告构建，TDP-43敲除细胞系（HEK 293T），转染条件，检测方法。 阅读提示：Methods: Splicing reporter assay; Extended Data Fig. 8; Extended Data Fig. 10a |
| 生存分析 | 患者队列（205例 FTLD-TDP），数据来源（Mayo Clinic），Cox模型调整变量（遗传突变、性别、发病年龄），加性/显性/隐性模型。 阅读提示：Methods: Statistical methods; Fig. 4f; Extended Data Fig. 10b-f |