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        基因型特异性特征降低南美黄热病毒株对疫苗诱导抗体的敏感性

        Genotype-specific features reduce the susceptibility of South American yellow fever virus strains to vaccine-induced antibodies

        作者信息Denise Haslwanter, Gorka Lasso, Anna Z Wec, Nathália Dias Furtado, Lidiane Menezes Souza Raphael, Alexandra L Tse, Yan Sun, Stephanie Stransky, Núria Pedreño-Lopez, Carolina Argondizo Correia, Zachary A Bornholdt, Mrunal Sakharkar, Vivian I Avelino-Silva, Crystal L Moyer, David I Watkins, Esper G Kallas, Simone Sidoli, Laura M Walker, Myrna C Bonaldo, Kartik Chandran
        PMID34998466
        期刊Cell Host Microbe
        发布时间2022-02-09
        DOI10.1016/j.chom.2021.12.009
        来源查看原文

        实验完整度

        高

        包含体外中和试验、RVP系统、嵌合病毒、位点突变、质谱分析、系统发育分析等多层次验证。

        主要模型

        YF-17D疫苗免疫的美国捐献者血清 YF-17DD疫苗免疫的巴西捐献者血清 YFV-ES-504毒株 YFV-17D毒株

        重点核对

        RVP系统用于评估血清中和滴度 FRNT试验用于评估血清和单克隆抗体的中和活性 DII嵌合体和位点突变体用于定位关键氨基酸 质谱分析用于检测N-糖基化 系统发育分析用于评估序列保守性

        摘要

        黄热病在南美洲的再次出现促使人们针对其病原体黄热病毒（YFV）进行疫苗接种。目前的疫苗基于源自有毒力的非洲分离株的减毒活病毒YF-17D。这些疫苗诱导针对疫苗株的中和抗体的能力被用作保护的替代指标。然而，遗传上不同的南美毒株对疫苗诱导抗体的敏感性尚不清楚。我们发现，疫苗接种者中多克隆抗体反应的抗病毒效力对出现的巴西毒株减弱。这种减弱归因于糖蛋白E中央结构域II中两个位点的氨基酸变化，包括结构域I-结构域II铰链区的多个变化，这些变化在南美大多数YFV毒株中是独特且共有的。我们的发现呼吁重新评估当前南美YFV免疫监测的方法，并提出更新疫苗的方法。

        实验结论

        提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。

        研究问题
        遗传上不同的南美YFV毒株对疫苗诱导抗体的敏感性是否降低？其分子基础是什么？
        核心机制
        YFV-ES-504 E蛋白DII结构域中两个位点的氨基酸变化（位点1和位点2）导致其对抗体的中和敏感性降低；位点2的N269糖基化和N272K变化是主要决定因素。
        主要证据
        通过RVP和FRNT试验证明血清和单克隆抗体对ES-504的中和能力降低；通过嵌合病毒和位点突变定位到DII；通过质谱和PNGase F处理证实N269糖基化。
        研究意义
        研究结果提示当前南美YFV免疫监测方法可能高估了疫苗诱导的抗体反应，并建议更新疫苗以应对南美毒株。

        研究路径

        按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

        1

        血清中和活性评估

        评估YF-17D疫苗接种者血清对多种YFV毒株的中和活性

        使用基于西尼罗病毒的RVP系统检测三个美国捐献者（供体1-3）在多个时间点的血清中和滴度，对比YF-17D、Asibi、China和ES-504的E蛋白。

        2

        单克隆抗体结合和中和分析

        筛选YF-17D疫苗者来源的E特异性单克隆抗体对ES-504 E蛋白的结合和中和活性

        通过BLI检测99个单克隆抗体与重组sE蛋白的结合，并通过RVP和FRNT检测中和活性。

        3

        决定中和敏感性差异的E蛋白结构域定位

        确定YFV-17D和ES-504之间中和敏感性差异的E蛋白区域

        构建DI、DII、DIII结构域交换的嵌合RVP，检测疫苗者血清和DII、DIII特异性单克隆抗体的中和活性。

        4

        鉴定DII中影响中和的两个位点

        验证DII中特定位点突变对中和敏感性的影响

        构建位点1和位点2交换的嵌合RVP，检测单克隆抗体和血清的中和活性，同时综合位点1和位点2的变化。

        5

        验证N-糖基化和N272K的作用

        阐明位点2的分子机制，包括N-糖基化和氨基酸替换

        通过质谱分析重组sE蛋白的N-糖基化状态，通过PNGase F处理验证糖基化，并构建位点2亚位点突变体检测血清中和。

        6

        系统发育分析

        评估位点1和位点2在南美YFV毒株中的保守性

        收集281个YFV E蛋白序列，进行多重序列比对和系统发育树构建，分析位点1和位点2的分布。

        7

        中和敏感性的功能验证

        验证YFV-Bolivia（基因型II）对疫苗者血清的中和敏感性

        构建携带YFV-Bolivia E蛋白的RVP，检测其被疫苗者血清中和的能力。

        研究方法

        按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。

        验证样本或模型特征
        生物层干涉法质谱分析
        验证细胞功能变化
        报告病毒颗粒中和试验蚀斑减少中和试验
        验证分子表达变化
        蛋白质印迹PNGase F处理
        验证机制链路
        嵌合RVP构建定点突变
        数据分析与统计
        系统发育分析非线性回归分析

        产品清单

        实验环节名称品牌货号
        细胞培养高糖DMEM培养基Gibco--
        胎牛血清Atlanta Biologicals--
        青霉素/链霉素Gibco--
        Gluta-MAX补充剂Gibco--
        HEPES缓冲液Gibco--
        Earle's 199培养基Gibco--
        Leibovitz's L-15培养基Gibco--
        重组蛋白生产pMT-puro载体----
        StrepTrap HP层析柱GE Healthcare--
        S200 Increase分子筛层析柱GE Healthcare--
        单克隆抗体生产蛋白A亲和层析----
        BLI检测FortéBio Octet HTX仪器Molecular Devices--
        中和试验96孔板Costar3595
        4G2单克隆抗体ATCC--
        Hoechst-33342染色液Invitrogen--
        Cytation-5自动荧光显微镜BioTek--
        FRNT试验Earle's 199培养基Sigma-Aldrich--
        Vero细胞ATCCCCL81
        BD Cytofix/Cytoperm固定破膜液BD Biosciences--
        4G2单克隆抗体EMD MilliporeMAB10216
        True-Blue过氧化物酶底物KPL--
        质谱分析Dionex RSLC Ultimate 300液相色谱系统Thermo Scientific--
        Orbitrap Fusion Lumos质谱仪Thermo Scientific--
        测序级修饰胰蛋白酶PromegaV5111
        Oasis HLB 30μm固相萃取材料Waters186007549
        Repro-Sil Pur C18-AQ 3μm色谱填料Dr. Maisch GmbHr13.aq.0003
        PNGase F处理肽N-糖苷酶FNew England Biolabs--
        Western blotBolt 4-12% Bis-Tris Plus凝胶Invitrogen--
        iBlot干转印系统Invitrogen--
        EZ-Link Plus活化过氧化物酶试剂盒Thermo Scientific--
        Pierce ECL Plus Western blot底物Thermo Scientific--
        iBright FL1500成像系统Invitrogen--
        Chameleon Duo蛋白质分子量标准Li-Cor--
        cOmplete Lysis-M裂解缓冲液Roche--
        ECL Prime Western blot系统Amersham--
        广范围预染SDS-PAGE标准品Bio-Rad--
        免疫沉淀Dynabeads™蛋白G磁珠Invitrogen10004D
        系统发育分析CD-HIT----
        MUSCLE----
        PhyML----
        iTol----
        结构建模Chimera----
        Modeller----
        表位预测BepiPred-2----

        关键环节

        汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

        环节核对要点
        血清中和试验
        疫苗接种者供体信息和采血时间点，血清稀释度，RVP或病毒株类型
        阅读提示：STAR Methods中的 'U.S. cohort'、'Brazilian cohort'和'Microtiter neutralization assays'
        单克隆抗体结合检测
        单克隆抗体的浓度和来源，重组E蛋白的序列和表达系统，BLI仪器和传感器
        阅读提示：STAR Methods中的 'Monoclonal antibodies'和'Biolayer Interferometry Kinetic Measurements'
        RVP产生
        WNV复制子质粒和C-prM-E质粒的构建，转染细胞系和比例，收获时间和纯化方法
        阅读提示：STAR Methods中的 'Reporter virus particle (RVP) generation'
        嵌合和突变RVP
        结构域边界和突变位点，基因合成和克隆方法，序列编号参考
        阅读提示：STAR Methods中的 'Reporter virus particle (RVP) generation'和Figure 3和5的图注
        N-糖基化分析
        重组E蛋白的表达和纯化，质谱仪参数，PNGase F处理条件
        阅读提示：STAR Methods中的 'Mass spectrometry of glycopeptides'和'Co-Immunoprecipitations, PNGase F treatment, and Western blotting'

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