单细胞转录组图谱构建
描绘LUAD微环境中免疫与非免疫细胞组成及阶段分布。
整合GSE131907、GSE189357及自有队列共28个样本的scRNA-seq数据，经质量控制、批次校正、聚类注释，获得152,686个高质量细胞。
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单细胞分析揭示FAM117A作为连接巨噬细胞-上皮细胞互作与肺腺癌进展的关键调控因子
Single-cell profiling reveals FAM117A as a key regulator linking macrophage-epithelial crosstalk with the progression of lung adenocarcinoma
实验完整度
高包含单细胞转录组分析、体外细胞功能实验、免疫共沉淀、体内异种移植瘤模型及临床样本验证。
主要模型
A549细胞系 NCI-H1975细胞系 BALB/c裸鼠异种移植瘤模型 LUAD患者组织样本 scRNA-seq数据集（GSE131907、GSE189357及自有队列）
重点核对
SPP1+巨噬细胞与基底细胞通讯模块（CIM）的富集与临床预后关联 FAM117A与DYRK1A的物理相互作用（Co-IP验证） FAM117A或DYRK1A敲低对细胞周期相关蛋白（Cyclin D1, p21, p27, phospho-CDK4）的影响 FAM117A敲低对异种移植瘤生长的影响（BALB/c裸鼠，n=6/组） LUAD组织中FAM117A表达与SPP1+巨噬细胞密度及预后的相关性
摘要
肿瘤微环境（TME）对肺腺癌（LUAD）的进展及其对治疗的反应具有深远影响。我们基于单细胞RNA测序识别出一个促肿瘤通讯网络。该网络显示一个SPP1+巨噬细胞和基底上皮细胞通讯模块（CIM），该模块在肿瘤侵袭部分富集，并与细胞毒性T细胞活性降低和不良预后相关。转录组建模确定FAM117A是CIM网络的主要抑制因子。FAM117A是一种与DYRK1A相互作用的细胞周期调控因子。FAM117A的缺失导致G1/S转换时间延长、细胞增殖增加以及巨噬细胞-上皮细胞反馈环路增强。免疫组织化学研究显示，LUAD组织中FAM117A表达降低，这与SPP1+巨噬细胞密度和不良预后相关。使用FAM117A治疗或药理抑制CDK4/6可减少体外和体内肿瘤生长。因此，FAM117A将内在细胞周期调控与外在免疫微环境联系起来，为针对巨噬细胞-肿瘤和细胞周期调控事件的联合治疗提供了理论依据。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 探究肺腺癌进展中巨噬细胞与上皮肿瘤细胞的互作机制，并揭示FAM117A在此调控网络中的作用。
- 核心机制
- SPP1+巨噬细胞通过分泌IL1A、IL1B、IL6、TNF及IGF1/IGFBP3等因子与基底细胞通讯，促进肿瘤增殖；FAM117A与DYRK1A相互作用，抑制G1/S转换，其缺失导致细胞增殖加速。
- 主要证据
- 单细胞转录组分析、NicheNet配体-受体分析、Co-IP、Western blot、流式细胞术、异种移植瘤模型及临床样本IHC验证。
- 研究意义
- 该研究为联合靶向巨噬细胞-肿瘤互作和细胞周期调控的LUAD治疗策略提供了理论依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
巨噬细胞亚群鉴定与功能分析
明确巨噬细胞异质性及其与LUAD进展和预后的关联。
通过marker基因鉴定SPP1+、MARCO+、FABP4+、APOE+巨噬细胞亚群，进行拟时序分析、SCENIC转录因子活性分析及GSVA生存分析。
上皮细胞亚群鉴定及恶性潜能评估
分析上皮细胞异质性，识别恶性亚群及其临床意义。
鉴定AT2、APOD+、基底、纤毛、AT1细胞亚群，利用inferCNV评估CNV评分，并进行GSVA生存分析。
细胞通讯网络及CIM模块构建
揭示SPP1+巨噬细胞与基底细胞的互作及其预后价值。
使用CellChat和NicheNet分析细胞互作，鉴定关键配体-受体对；基于13基因LASSO模型构建CIM评分系统。
FAM117A表达及临床相关性验证
验证FAM117A在LUAD组织中的表达及其与细胞周期调控的关联。
通过Western blot、qPCR和IHC检测FAM117A、p21、Cyclin D1的表达。
FAM117A-DYRK1A相互作用及功能验证
探究FAM117A调控细胞周期G1/S转换的分子机制。
免疫共沉淀确认相互作用；siRNA敲低后通过Western blot和流式细胞术检测细胞周期及蛋白变化。
体内异种移植瘤模型验证
验证FAM117A缺失对体内肿瘤生长的影响。
A549细胞（对照或FAM117A敲低）皮下接种BALB/c裸鼠，监测肿瘤体积和重量。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞消化与单细胞悬液制备 | Dispase II | -- | -- |
| VIII型胶原酶 | -- | -- | |
| 单细胞测序文库构建 | Chromium单细胞3'试剂盒 | 10x Genomics | -- |
| 单细胞测序 | Illumina HiSeq X Ten | Illumina | -- |
| 多重免疫组化 | Opal Polaris™ 7色手动免疫组化试剂盒 | AKOYA Biosciences | NEL861001KT |
| Mowoil | Sigma-Aldrich | 81381 | |
| DAPI | Beyotime | C1002 | |
| 多重免疫组化成像 | Vectra Polaris定量成像系统 | PerkinElmer | -- |
| HE染色 | 苏木素 | Solarbio | G1080 |
| 伊红 | Solarbio | G1100 | |
| 蛋白质印迹 | RIPA裂解液 | Solarbio | R0020 |
| 蛋白酶抑制剂 | Solarbio | P6731 | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P0010S | |
| 硝酸纤维素膜 | Merck Millipore | HATF00010 | |
| 荧光定量PCR | RNeasy Mini试剂盒 | QIAGEN | 74106 |
| SMART MMLV逆转录酶 | Takara Bio | 639524 | |
| SYBR green荧光定量PCR预混液 | Quantabio | 95056-02K | |
| 质谱分析 | 胰蛋白酶（测序级） | Promega | -- |
| Easy-nLC 1000超高效液相色谱系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Q Exactive质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 异种移植瘤模型 | 基质胶 | Corning | -- |
| 抗体 | FAM117A抗体 | -- | -- |
| p21抗体 | -- | -- | |
| Cyclin D1抗体 | -- | -- | |
| DYRK1A抗体 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 单细胞转录组样本处理与测序 | 样本来源（GSE131907、GSE189357、自有队列）、消化酶（Dispase II、VIII型胶原酶、DNase I）、孵育时间（40分钟）、死细胞去除试剂盒 阅读提示：Methods: Single-cell data processing |
| 细胞通讯分析 | CellChat、NicheNet软件版本及参数、配体-受体对 阅读提示：Methods: Cell-cell interaction analysis |
| CIM评分构建 | LASSO回归中使用的基因集、交叉验证折数、λ选择标准 阅读提示：Methods: CIM scoring system |
| 多重免疫组化 | 组织切片厚度（4μm）、抗原修复条件、抗体浓度及孵育时间、Opal试剂使用顺序 阅读提示：Methods: Multiplex immunohistochemistry (mIHC) |
| 蛋白质印迹 | 抗体稀释比例、孵育时间、内参蛋白（GAPDH）、独立重复次数（3次） 阅读提示：Methods: Western blotting |
| Co-IP实验 | 细胞系（A549、NCI-H1975）、Flag标签抗体、IP条件 阅读提示：Results: FAM117A interacts with DYRK1A to regulate the G1/S transition; Figure 7B |
| 细胞周期分析 | siRNA序列、转染条件、流式细胞术染色方法、细胞周期各阶段比例 阅读提示：Results: FAM117A interacts with DYRK1A to regulate the G1/S transition; Figure 7C |
| 异种移植瘤实验 | 小鼠品系（BALB/c nude）、周龄（4-6周）、细胞接种量（3.0×10^6）、基质胶比例、注射部位、监测频率 阅读提示：Methods: Xenograft tumor formation assay; Figure 8B |