样品收集与分组
获取不同组别的口腔组织样本以进行蛋白质组学分析。
从海南总医院口腔颌面外科收集OSCC组织样本，根据是否咀嚼槟榔分为槟榔相关OSCC组，非槟榔相关OSCC组，以及正常口腔黏膜组织组。
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使用串联质量标签蛋白质组学筛选槟榔相关口腔鳞状细胞癌中差异表达的蛋白质
Screening Differentially Expressed Proteins in Areca Nut-Related Oral Squamous Cell Carcinoma Using Tandem Mass Tag Proteomics
实验完整度
中包含TMT发现阶段和WB、IHC验证阶段，但缺乏体外或体内功能实验验证。
主要模型
口腔鳞状细胞癌组织样本（槟榔相关、非槟榔相关及正常口腔黏膜）
重点核对
样本分组：槟榔相关OSCC组（A组）、非槟榔相关OSCC组（B组）、正常口腔黏膜组织组（C组） 样本量：TMT分析每组5例，WB和IHC验证每组10例 TMT标记：使用TMT 10plex标记试剂盒 WB抗体浓度和稀释度：MYH6（Proteintech, 1:5000）、MB（Proteintech, 1:1000）、TNNC1（Proteintech, 1:1000）、MMP10（Beyotime, 1:1000）、LZTS1（Proteintech, 1:1000）、GAPDH（Zenbio, 1:5000） IHC抗体浓度和稀释度：MYH6（1:50）、MB（1:50）、TNNC1（1:100）、MMP10（1:50）、LZTS1（1:50）
摘要
目的：槟榔咀嚼与口腔鳞状细胞癌（OSCC）的不良预后相关。本研究旨在鉴定槟榔相关OSCC、非槟榔相关OSCC及邻近正常上皮组织中的差异表达蛋白，以期为槟榔相关OSCC的研究提供新的见解。方法：采用基于串联质量标签（TMT）的蛋白质组学分析，对槟榔相关OSCC、非槟榔相关OSCC及邻近正常上皮组织（n=15）进行比较蛋白质组学分析。随后采用GO和KEGG富集分析，以鉴定与OSCC发病机制相关的显著蛋白进行进一步研究。使用Western Blot（WB）和免疫组织化学（IHC）技术初步验证LZTS1、MMP10、MYH6、MB和TNNC1在不同组别（n=30）中的表达模式。结果：将槟榔相关OSCC组与非槟榔相关OSCC组及正常上皮组织组进行比较，共鉴定出27种差异表达蛋白。其中15种蛋白上调，12种蛋白下调。LZTS1和MMP10包含在上调蛋白中，而MYH6、MB和TNNC1下调。WB和IHC分析证实了蛋白质组学结果，这5种蛋白在各组中的表达趋势一致。结论：LZTS1、MMP10、MYH6、MB和TNNC1有望成为评估槟榔相关OSCC疾病进展、预后和潜在靶向治疗的生物标志物。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 槟榔相关OSCC、非槟榔相关OSCC与正常口腔黏膜组织间是否存在差异表达蛋白，这些蛋白是否可作为诊断、预后和治疗的生物标志物？
- 核心机制
- 文中未明确说明
- 主要证据
- 通过TMT蛋白质组学分析鉴定出27种在槟榔相关OSCC与非槟榔相关OSCC及正常组织比较中共同异常表达的蛋白，随后用WB和IHC验证了LZTS1、MMP10、MYH6、MB和TNNC1的表达趋势。
- 研究意义
- 这些蛋白可能作为评估疾病进展、预后和潜在靶向治疗的生物标志物，并为槟榔相关OSCC的研究提供新见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
蛋白质提取和TMT标记
提取组织蛋白质并进行TMT标记，以用于比较蛋白质组学分析。
采用SDT裂解法提取总蛋白，BCA法进行蛋白定量，FASP酶解后，按照TMT10plex试剂盒说明书进行标记。
高效液相色谱分级和质谱鉴定
对标记肽段进行分级并使用LC-MS/MS进行蛋白质鉴定和定量。
使用Agilent 1260 infinity II HPLC系统进行高pH反相分级，使用Easy nLC系统分离肽段，并通过Q Exactive Plus质谱仪进行分析。
生物信息学分析
鉴定差异表达蛋白并进行功能富集分析。
使用Proteome Discoverer 2.1和MASCOT2.6进行数据库搜索，筛选DEPs，并进行GO和KEGG富集分析。
Western Blot验证
验证候选蛋白的表达趋势。
通过Western Blot检测LZTS1、MMP10、MYH6、MB和TNNC1在各组中的表达。
免疫组织化学验证
验证候选蛋白的表达定位和表达水平。
通过IHC检测LZTS1、MMP10、MYH6、MB和TNNC1在各组组织中的表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白提取与定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P0012 |
| RIPA裂解液 | -- | -- | |
| 质谱分析 | TMT 10plex标记试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 高效液相色谱分级 | Agilent 1260 infinity II高效液相色谱系统 | Agilent | -- |
| LC-MS/MS分析 | Easy nLC系统 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Q Exactive Plus质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Western Blot | PVDF膜 | -- | -- |
| MYH6抗体 | Proteintech | -- | |
| MB抗体 | Proteintech | -- | |
| TNNC1抗体 | Proteintech | -- | |
| MMP10抗体 | Beyotime | -- | |
| LZTS1抗体 | Proteintech | -- | |
| GAPDH抗体 | Zenbio | -- | |
| 二抗 | Biosharp | -- | |
| 免疫组织化学 | MYH6抗体 | Proteintech | 22281-1-AP |
| MB抗体 | Proteintech | 16048-1-AP | |
| TNNC1抗体 | Proteintech | 13504-1-AP | |
| MMP10抗体 | Beyotime | AF7476 | |
| LZTS1抗体 | Proteintech | 20878-1-AP | |
| 二抗 | Biosharp | BL003A | |
| DAB显色试剂 | Solarbio | DA1016 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本收集与分组 | 槟榔咀嚼史年限（至少5年）、无饮酒吸烟史、样本来源于海南总医院、正常黏膜取自距肿瘤2cm处 阅读提示：Patients Selection and ethical statement部分 |
| TMT蛋白质组学 | 每组样本量5例、TMT标记试剂盒、LC-MS/MS参数 阅读提示：Proteolytic digestion and TMT labeling、LC-MS/MS Analysis部分 |
| Western Blot | 每组样本量10例、抗体稀释度、电泳条件 阅读提示：Preliminary verification of DEPs by WB部分 |
| 免疫组织化学 | 每组样本量10例、抗原修复条件、抗体稀释度 阅读提示：Preliminary verification of DEPs by IHC部分 |