构建自发性ccRCC小鼠模型
模拟人ccRCC的遗传背景，研究HIF-1α和HIF-2α在肿瘤发生中的作用
通过他莫昔芬诱导Ksp-CreERT2介导的Vhl、Trp53、Rb1缺失，并引入Hif1a或Hif2a的floxed等位基因，建立VpR、VpRH1和VpRH2小鼠模型。
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HIF-1α和HIF-2α在小鼠透明细胞肾细胞癌中差异性调节肿瘤发展和炎症
HIF-1α and HIF-2α differently regulate tumour development and inflammation of clear cell renal cell carcinoma in mice
实验完整度
高包含自发性小鼠肿瘤模型、细胞增殖实验、异种移植、转录组和蛋白质组分析、免疫组化及免疫细胞浸润分析等多层验证。
主要模型
Ksp-CreERT2; Vhlfl/fl; Trp53fl/fl; Rb1fl/fl小鼠ccRCC模型 Vhlfl/fl; Trp53fl/fl; Rb1fl/fl; Hif1afl/fl小鼠 Vhlfl/fl; Trp53fl/fl; Rb1fl/fl; Hif2afl/fl小鼠 Vhl∆/∆Trp53∆/∆Rb1∆/∆小鼠来源的2020 ccRCC细胞系
重点核对
小鼠模型中Vhl、Trp53、Rb1、Hif1a和Hif2a的敲除效率 肿瘤形成、数量和生长率的统计比较 HIF-1α和HIF-2α对转录组和蛋白质组的影响 免疫细胞浸润和激活的量化 人ccRCC中HIF1A拷贝数或HIF2A表达与免疫标志物的相关性
摘要
VHL的突变失活是大多数透明细胞肾细胞癌（ccRCC）中最早期的遗传事件，导致HIF-1α和HIF-2α转录因子的积累。虽然对人ccRCC的相关性研究和对人ccRCC细胞系的功能研究已表明HIF-1α是侵袭性肿瘤行为的抑制剂，HIF-2α是其促进剂，但它们在肿瘤发生中的作用尚未得到功能性研究。在此，我们使用一种自发性ccRCC模型表明，Hif1a对肿瘤形成是必需的，而Hif2a的缺失对肿瘤起始和生长仅有轻微影响。HIF-1α和HIF-2α都是透明细胞表型所必需的。转录组和蛋白质组分析显示，HIF-1α调节糖酵解，而HIF-2α调节与脂蛋白代谢、核糖体生物发生以及E2F和MYC转录活性相关的基因。HIF-2α缺陷型肿瘤的特征是抗原呈递、干扰素信号传导以及CD8+ T细胞浸润和活化增加。HIF1A的单拷贝缺失或HIF2A mRNA高表达与人ccRCC中免疫微环境的改变相关。这些研究揭示了HIF-1α在ccRCC起始中的致癌作用，并提示HIF-1α和HIF-2α活性平衡的改变可影响ccRCC生物学和疾病侵袭性的不同方面。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 在自发性ccRCC模型中，HIF-1α和HIF-2α在肿瘤形成和发展中分别扮演什么角色？
- 核心机制
- HIF-1α通过调节糖酵解促进肿瘤形成；HIF-2α调节脂蛋白代谢、核糖体生物发生和MYC/E2F活性，并抑制抗原呈递和T细胞浸润。
- 主要证据
- 自发性小鼠模型中Hif1a缺失几乎完全抑制肿瘤形成，Hif2a缺失仅部分影响；转录组和蛋白质组显示HIF-1α调控糖酵解，HIF-2α调控免疫相关通路；免疫组化显示HIF-2α缺失增加CD8+ T细胞浸润和活化。
- 研究意义
- 揭示了HIF-1α在ccRCC起始中的必需作用，并提示HIF-1α/HIF-2α活性平衡影响肿瘤生物学和免疫，为靶向HIF-1α或双重抑制提供依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
肿瘤表型分析
比较不同基因型小鼠的肿瘤发生时间、数目和生长率
使用μCT成像追踪肿瘤，计算肿瘤发生时间和生长速率，并组织学分析肿瘤分级和透明细胞评分。
细胞实验验证
评估HIF-1α在细胞增殖和异种移植中的作用
使用MEFs和2020细胞系，通过shRNA敲低Hif1a，进行增殖、球体形成和异种移植实验。
转录组和蛋白质组分析
识别HIF-1α和HIF-2α调控的基因和蛋白程序
对WT皮质和不同基因型肿瘤进行RNA-seq和质谱分析，通过GAGE和GSEA分析富集通路。
免疫微环境分析
评估HIF-1α和HIF-2α对肿瘤免疫浸润的影响
通过免疫组化染色检测T细胞、B细胞、巨噬细胞等标记，并使用多种反卷积方法分析RNA-seq数据。
人ccRCC相关性分析
验证小鼠发现与人ccRCC的相关性
分析TCGA KIRC数据，比较HIF1A拷贝数变异和HIF2A表达与免疫细胞浸润及患者生存的关系。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 小鼠基因敲除诱导 | 他莫昔芬 | -- | 10540-29-1 |
| 细胞感染 | Ad-Cre-GFP腺病毒 | Vector Biolabs | #1700 |
| Ad-CMV-GFP腺病毒 | Vector Biolabs | #1060 | |
| 细胞培养 | 胶原酶II | -- | -- |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| Ham's F12培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 胰岛素 | -- | 11061-68-0 | |
| 前列腺素E1 | -- | 745-65-3 | |
| 三碘甲状腺原氨酸 | -- | 6893-02-3 | |
| 转铁蛋白 | -- | 11096-37-0 | |
| 氢化可的松 | -- | 50-23-7 | |
| 表皮生长因子 | -- | -- | |
| 细胞增殖实验 | 磺基罗丹明B | -- | -- |
| 球体形成实验 | 低附着培养板 | Corning | -- |
| DKM 23U274相机 | -- | -- | |
| Eclipse Ts2R-FL显微镜 | Nikon | -- | |
| IC Capture 2.4软件 | -- | -- | |
| ImageJ软件 | -- | -- | |
| 异种移植 | Accutase | Gibco | -- |
| 基质胶 | Corning | -- | |
| 肿瘤监测 | 对比增强微计算机断层扫描 | -- | -- |
| 条件培养基T细胞增殖实验 | CD8a（Ly-2）磁珠 | Miltenyi Biotech | -- |
| CellTrace紫增殖染料 | Thermo Fisher | -- | |
| CD3/CD28磁珠 | Thermo Fisher | -- | |
| 白细胞介素2 | -- | -- | |
| 活/死可固定水荧光死细胞染色试剂盒 | Thermo Fisher | -- | |
| CD16/32抗体 | Fisher Scientific | 14016185 | |
| CD8a抗体（APC偶联） | Biolegend | 100712 | |
| BD LSRFortessa流式细胞仪 | BD | -- | |
| FlowJo软件 | -- | -- | |
| 免疫组织化学 | B220抗体 | BD Biosciences | 553084 |
| CA9抗体 | Invitrogen | PA1-16592 | |
| CD3抗体 | Zytomed | RBK024 | |
| CD4抗体 | eBioscience | 14-9766 | |
| CD8a抗体 | Invitrogen | 14-0808-82 | |
| CD10抗体 | Thermo Fisher Scientific | PA5-47075 | |
| CD68抗体 | abcam | ab125212 | |
| CD69抗体 | Bioss | bs-2499R | |
| F4/80抗体 | Linaris Biologische Produkte | T-2006 | |
| HIF-1α抗体 | Novus Biotechnologies | NB-100-105 | |
| HIF-2α抗体 | abcam | ab109616 | |
| Ly-6G抗体 | BD | 551459 | |
| MHC II抗体 | Novus Biotechnologies | NBP1-43312 | |
| PD-1抗体 | R&D systems | AF1021 | |
| 穿孔素抗体 | Biorbyt | orb312827 | |
| 磷酸化Thr37/Thr46-4E-BP1抗体 | Cell Signalling Technologies | 2855 | |
| 催化信号放大试剂盒 | DakoCytomation | -- | |
| BOND酶预处理试剂盒 | Leica | AR9551 | |
| 免疫组织化学扫描 | Nanozoomer扫描系统 | Hamamatsu Photonics | -- |
| 免疫组织化学定量 | VIS软件套件 | Visiopharm | -- |
| mRNA表达分析 | NucleoSpin RNA提取试剂盒 | Machery Nagel | -- |
| Ready-To-Go You-Prime第一链合成珠 | GE Healthcare | -- | |
| LightCycler 480 SYBR Green预混液 | Roche | -- | |
| LightCycler 480实时荧光定量PCR仪 | Roche | -- | |
| 基因组DNA提取 | GeneElute哺乳动物基因组DNA小量提取试剂盒 | Sigma-Aldrich | -- |
| Western blot | β-肌动蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | A2228 |
| HIF-1α抗体 | Novus Biologicals | NB-100-479 | |
| 核纤层蛋白A/C抗体 | Santa Cruz | sc-376248 | |
| LDH-A抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-27230 | |
| PDK1抗体 | Assay Designs | KAP-PK112-0 | |
| VHL抗体 | Cell Signalling Technologies | #68547 | |
| 纽蛋白抗体 | Abcam | ab130007 | |
| RNA测序 | Illumina TruSeq链式RNA文库制备试剂盒 | Illumina | -- |
| Illumina HISEQ4000测序仪 | Illumina | -- | |
| 蛋白质组学 | TMT11plex标记试剂 | Thermo/Pierce | -- |
| XBridge C18色谱柱 | Waters | -- | |
| EASY nano-LC系统1000 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| EASY-Spray™ C18色谱柱 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Oribtrap Q-Exactive Plus质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| MaxQuant v 1.6.013软件 | -- | -- | |
| MSStatsTMT软件 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠模型建立 | 小鼠遗传背景（Ksp-CreERT2; Vhlfl/fl; Trp53fl/fl; Rb1fl/fl），他莫昔芬诱导条件（6周龄，400ppm食物2周） 阅读提示：Methods节：Mice |
| 肿瘤监测 | μCT成像频率（每月），肿瘤体积计算方法（椭球公式） 阅读提示：Methods节：µCT imaging |
| 细胞系建立 | 2020细胞系来源（Vhl∆/∆Trp53∆/∆Rb1∆/∆小鼠肿瘤），消化条件（1mg/ml胶原酶II，70分钟） 阅读提示：Methods节：Generation of MEFs and mouse ccRCC cell line |
| 细胞增殖实验 | 接种密度（3000细胞/孔），培养时间（6天），SRB定量方法 阅读提示：Methods节：MEF and ccRCC cell proliferation assays |
| 异种移植 | 细胞数（5×10^6），接种部位（皮下），动物品系（SCID-Beige） 阅读提示：Methods节：Allograft assay |
| 免疫组化染色 | 一抗浓度、抗原修复条件（如B220 1:3000，Tris/EDTA 20min） 阅读提示：Methods节：Immunohistochemistry |
| RNA-seq分析 | 测序平台（Illumina HISEQ4000），比对软件（STAR），差异表达分析（DESeq2） 阅读提示：Methods节：RNA-sequencing |
| 蛋白质组学分析 | 标记试剂（TMT11plex），LC-MS/MS条件，MaxQuant参数 阅读提示：Methods节：Mass spectrometry-based proteome profiling |
| 免疫细胞浸润分析 | 免疫组化标记和定量方法（如CD3、CD4、CD8等），免疫反卷积方法（ssGSEA、CIBERSORT） 阅读提示：Methods节：Immunohistochemistry 和 ssGSEA immune deconvolution analysis |
| 人数据相关性分析 | TCGA KIRC数据集，HIF1A拷贝数变异和HIF2A表达分组，生存分析 阅读提示：Results节：Fig. 7 |