转录组分析
鉴定Foxf2调控的下游基因和通路
对Foxf2iECKO和Ctrl小鼠的BECs进行scRNA-seq，对FOXF2KO和WT人iECs进行bulk RNA-seq，分析差异表达基因。
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卒中风险基因Foxf2通过Tie2信号维持脑内皮细胞功能
The stroke risk gene Foxf2 maintains brain endothelial cell function via Tie2 signaling
实验完整度
高研究包含小鼠体内模型（Foxf2iECKO）和人类iPSC来源内皮细胞，进行转录组、蛋白质组、ChIP-seq等多组学分析，并通过药理学干预验证功能机制。
主要模型
Foxf2iECKO小鼠（Cdh5-CreERT2;Foxf2fl/fl） FOXF2敲除人iPSC来源内皮细胞（FOXF2KO iECs） SVD患者脑组织样本
重点核对
Foxf2iECKO小鼠在3月龄时通过腹腔注射他莫昔芬（0.25 mg/g）诱导基因敲除 BECs分离采用MACS CD31微珠富集 BBB渗漏检测使用EB、TMR-葡聚糖、CB-葡聚糖和A555-尸胺等多种示踪剂 AKB-9778体内给药剂量为30 mg/kg，腹腔注射4次，间隔12小时 MCAO手术采用硅胶包被线栓，阻塞60分钟
摘要
脑小血管病(SVD)是一种常见的慢性脑血管疾病，其病理机制尚不清楚。遗传学研究已将FOXF2确定为SVD和卒中的主要风险基因。FOXF2编码一种转录因子，主要在脑周细胞和内皮细胞(ECs)中表达；然而，其在脑血管疾病中的机制作用仍不清楚。在这里，我们表明Foxf2通过Tie2信号维持EC功能。RNA和染色质测序将FOXF2鉴定为Tie2和其他内皮谱系特异性基因的转录激活因子。成年小鼠内皮特异性Foxf2缺失导致血脑屏障渗漏，实验性卒中后加重。对缺乏FOXF2的Foxf2缺陷小鼠脑来源和人诱导多能干细胞来源的ECs的蛋白质组学分析显示，参与Tie2信号传导的多种蛋白质下调。内皮Foxf2缺陷通过破坏Tie2信号损害功能性充血，减少NO产生并增加梗死面积，这些效应可通过AKB-9778药理学激活Tie2而挽救。总之，我们的结果强调了Foxf2调控的Tie2信号在SVD和卒中中的关键作用，为治疗干预提供了新途径。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Foxf2在脑内皮细胞中如何发挥作用以维持其功能，以及其缺失如何与脑小血管病和卒中关联？
- 核心机制
- FOXF2作为转录激活子直接调控Tie2和其他内皮谱系基因表达，通过Tie2信号通路维持内皮屏障、促进NO产生和功能充血，并限制梗死面积。
- 主要证据
- 小鼠和人类细胞RNA-seq显示Foxf2缺失导致Tie2和Nos3下调；ChIP-seq证明FOXF2直接结合TIE2和VEGFR2；蛋白组学显示Tie2信号蛋白降低；AKB-9778激活Tie2可逆转表型。
- 研究意义
- 揭示了Foxf2-Tie2信号轴在SVD和卒中中的关键作用，为通过激活Tie2治疗这些疾病提供了新方向。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
染色质免疫沉淀测序
确定FOXF2的直接结合靶基因
对表达FOXF2-3xFLAG的人iECs进行ChIP-seq，分析FOXF2结合位点和靶基因。
血脑屏障渗漏检测
评估内皮Foxf2缺失对BBB完整性的影响
注射多种荧光示踪剂，通过荧光显微镜和荧光计测量渗漏；组织学分析SVD患者脑样本中的纤维蛋白原外渗。
蛋白质组学分析
鉴定Foxf2缺失导致的内皮蛋白组变化
分离BECs或脑微血管，进行LC-MS/MS蛋白质组学定量分析。
血管形态分析
评估Foxf2缺失对脑血管密度的影响
组织透明化后光片显微镜成像，VesSAP软件定量血管长度、分支密度等。
功能充血评估
检测内皮Foxf2缺失对CBF反应的影响
使用LSCI和双光子显微镜测量胡须刺激后的血流变化和血管直径变化。
卒中模型
评估Foxf2缺失对缺血损伤的影响
进行MCAO诱导卒中，分析梗死体积、BBB渗漏和神经功能评分。
药理学干预
验证Tie2激活对Foxf2缺失表型的修复作用
给予AKB-9778或安慰剂，评估对蛋白水平、BBB渗漏、功能充血和梗死体积的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| BBB渗漏检测 | 伊文思蓝 | Sigma-Aldrich | E2129 |
| A555偶联尸胺 | Invitrogen | A30677 | |
| CB偶联葡聚糖 | Invitrogen | D1976 | |
| TMR偶联葡聚糖 | Invitrogen | D1845 | |
| BEC分离 | 成人脑解离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-107-677 |
| CD31微珠 | Miltenyi Biotec | 130-097-418 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-5445-02 | |
| 细胞培养 | Essential 8 Flex培养基 | Thermo Fisher Scientific | A2858501 |
| iEC分化 | 中胚层诱导培养基 | STEMCELL Technologies | 05220 |
| APEL2培养基 | STEMCELL Technologies | 05270 | |
| CDH磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-097-867 | |
| IV型胶原 | Sigma-Aldrich | C5533-5MG | |
| 血管内皮生长因子 | Peprotech | 100-20 | |
| 细胞培养 | 胰蛋白酶-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 |
| NO测量 | DAF-2DA | Enzo Life Sciences | ALX-620-056-M001 |
| Fluoromount封片剂 | Sigma-Aldrich | F4680-25ML | |
| 蛋白提取 | NP40 | Sigma-Aldrich | 74385 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | 4693159001 | |
| 二硫苏糖醇 | Sigma-Aldrich | 3483-12-3 | |
| 十二烷基硫酸钠 | Serva | 20765.03 | |
| 蛋白质谱 | TimsTOF pro质谱仪 | Bruker | -- |
| nanoElute纳升高效液相色谱 | Bruker | -- | |
| ReproSil-Pur 120 C18-AQ色谱柱 | Maisch GmbH | -- | |
| Western blot | Immobilon ECL检测试剂 | Merck Millipore | -- |
| 免疫标记 | DAPI | Invitrogen | D1306 |
| 抗Flag抗体 | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| 血管成像 | 麦胚凝集素偶联Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | W11262 |
| 免疫标记 | Protein-G Dynabeads磁珠 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| ChIP-seq | Covaris S220超声破碎仪 | Covaris | 520045 |
| Thruplex DNA测序试剂盒 | Takara | R400674 | |
| RNA提取 | Trizol | Qiagen | 79306 |
| RNeasy小提试剂盒 | Qiagen | 74106 | |
| 逆转录 | Omniscript逆转录试剂盒 | Qiagen | 205113 |
| qPCR | SYBR Green预混液 | Qiagen | 208056 |
| 药物处理 | AKB-9778 | MedChem | HY-109041 |
| 血管生成素-1 | MedChem | HY-P70061 | |
| 缓激肽 | Enzo Life Sciences | ALX-152-006-M005 | |
| 流式分选 | CD11b抗体 | Invitrogen | 53-0112-82 |
| CD45抗体 | Invitrogen | 53-0451-82 | |
| Fixable Viability Dye eFluor 780 | Invitrogen | 65-0865-14 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | 他莫昔芬诱导条件：剂量、注射次数、时间点 阅读提示：Methods: Animals |
| BEC分离 | BEC分离中的酶解时间和温度、CD31磁珠富集步骤 阅读提示：Methods: BEC isolation |
| BBB渗漏检测 | 示踪剂分子量、注射方式、等待时间 阅读提示：Methods: BBB permeability assays |
| 药物处理 | AKB-9778剂量、给药途径、频率、时间 阅读提示：Methods: Pharmacological treatments |
| 卒中模型 | MCAO线栓规格、阻塞时间、排除标准 阅读提示：Methods: Experimental stroke model (MCAO) |
| 功能充血评估 | 刺激频率、成像窗口、麻醉药物 阅读提示：Methods: Assessment of vascular reactivity |