H1-0 is a specific mediator of the repressive ETV6::RUNX1 transcriptional landscape in preleukemia and B cell acute lymphoblastic leukemia
包含hiPSC模型、细胞系实验、患者样本转录组分析及PDX药物筛选等多层级证据，并进行功能验证和机制研究。
ETV6::RUNX1敲入hiPSC模型（HW8和ChiPSC12） ETV6::RUNX1+ BCP-ALL细胞系REH BCP-ALL患者来源异种移植（PDX）样本 293T细胞（用于报告基因实验）
CRISPR/Cas9基因编辑中RUNX1 HDR模板的正确插入（通过PCR和Sanger测序验证） siRNA介导的H1-0敲低效率（REH细胞中约2.4倍RNA降低） Quisinostat处理浓度（1 μM）和持续时间（24小时） 药物联用实验中的浓度范围和细胞密度（如REH：6000细胞/孔，PDX：3000细胞/孔）
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
建立模拟ETV6::RUNX1+白血病前期的细胞模型，用于研究其转录和功能效应。
使用CRISPR/Cas9介导的RUNX1 HDR模板靶向ETV6内含子5，在两种hiPSC系（HW8和ChiPSC12）中敲入RUNX1外显子2-8，形成生理性表达的ETV6::RUNX1融合基因。验证了敲入的正确性（PCR和Sanger测序）和ETV6::RUNX1的表达水平（RT-qPCR和Western blot）。
研究ETV6::RUNX1对早期造血谱系分化的影响，并验证H1-0表达在分化过程中的变化。
将hiPSC分化为造血祖细胞（HPC），进行scRNA-seq和流式细胞术分析，鉴定细胞类型和谱系分化轨迹，并检测H1-0表达。
确定ETV6::RUNX1是否直接或间接激活H1-0启动子。
克隆H1-0启动子区域（-351至+161）至荧光素酶报告载体，转染293T细胞，共表达ETV6::RUNX1或RUNX1，检测荧光素酶活性；另用Quisinostat处理检测启动子活性变化。
评估H1-0在ETV6::RUNX1+ BCP-ALL细胞中的功能作用，特别是对基因表达和细胞周期的影响。
在REH细胞中通过siRNA敲低H1-0，进行RNA-seq、GSEA、细胞增殖和细胞周期分析，以及药物敏感性实验。
评估HDACi（Quisinostat）与常规化疗药联合对ETV6::RUNX1+ BCP-ALL细胞的杀伤效果和协同作用。
使用384孔板进行药物组合筛选，检测细胞活力，计算ZIP协同分数，比较ETV6::RUNX1+和阴性样本的差异。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| hiPSC重编程 | CytoTune-iPS 2.0仙台病毒重编程试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | A16517 |
| 基因编辑 | pUC19质粒 | Addgene | 50005 |
| pCW-Cas9质粒 | Addgene | 50661 | |
| hiPSC培养 | StemPro Accutase 细胞解离液 | Thermo Fisher Scientific | A1110501 |
| Geltrex 基质胶 | Thermo Fisher Scientific | A1413301 | |
| mTeSR Plus培养基 | STEMCELL Technologies | -- | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | |
| 嘌呤霉素 | Thermo Fisher Scientific | A1113803 | |
| hiPSC分化 | STEMdiff造血分化试剂盒 | STEMCELL Technologies | 05310 |
| siRNA转染 | 4D核转染系统 | Lonza | -- |
| SF溶液 | Lonza | -- | |
| 双荧光素酶报告基因实验 | pGL4.22载体 | Promega | E6771 |
| pGL4.73载体 | Promega | E6911 | |
| Xfect转染试剂 | Clontech Laboratories | 631317 | |
| 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | E1910 | |
| 药物处理 | JNJ-26481585 (Quisinostat) | Selleck Chemicals | -- |
| AR-42 | Selleck Chemicals | -- | |
| 伏立诺他（SAHA） | MedChem Express | -- | |
| 长春新碱 | -- | -- | |
| 柔红霉素 | -- | -- | |
| 硼替佐米 | -- | -- | |
| 药物筛选 | CellTiter-Glo发光细胞活力检测试剂盒 | Promega | -- |
| 流式细胞术 | 流式细胞术抗体 | -- | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| hiPSC构建 | CRISPR/Cas9靶向序列、HDR模板设计、转染条件（细胞数、DNA量、电转程序）、筛选浓度（嘌呤霉素） 阅读提示：Methods: Molecular cloning of a RUNX1 HDR template, CRISPR/Cas9 editing of hiPSCs, Figure 1A |
| 造血分化 | hiPSC起始密度、分化培养基组分、时间点（12天） 阅读提示：Methods: In vitro differentiation of hiPSCs |
| H1-0敲低 | siRNA序列、浓度（200 pmol）、转染方法（4D Nucleofector program DS-150）、处理时间（48小时） 阅读提示：Methods: siRNA-mediated H1-0 knockdown, Figure 6A-D |
| 双荧光素酶报告基因实验 | 启动子片段（-351至+161）、质粒量（pGL4.22 500ng, Renilla 5ng, 表达质粒250ng）、细胞系（293T）、转染试剂（Xfect） 阅读提示：Methods: Dual-luciferase reporter assay, Figure 4B |
| 药物筛选 | 药物浓度范围、细胞密度（6000或3000细胞/孔）、处理时间（72小时）、DMSO浓度（1:10,000）、协同评分方法（ZIP） 阅读提示：Methods: In vitro inhibitor treatments, Figure 7B |
