HBV蛋白与宿主蛋白互作组分析
鉴定HBV各蛋白与宿主蛋白的物理相互作用网络。
在HUH7细胞中分别过表达HBV的Pol、HBc、HBx、HBe、SHB、MHB、LHB蛋白，通过亲和纯化质谱（AP-MS）鉴定相互作用蛋白，使用MiST评分筛选高置信度相互作用。
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HBV重塑PP2A复合物以重连肝细胞癌中的激酶信号
HBV Remodels PP2A Complexes to Rewire Kinase Signaling in Hepatocellular Carcinoma
实验完整度
高包含AP-MS蛋白互作组、CRISPRi功能筛选、磷酸化蛋白质组学、激酶活性分析、体外细胞实验和小鼠体内模型等多个独立证据层级，并进行功能验证和机制验证。
主要模型
HUH7细胞系 Hep3B细胞系 Akt/Ras驱动的Rictorfl/fl小鼠肝癌模型 TCGA LIHC HCC队列
重点核对
HBV蛋白与宿主蛋白相互作用（AP-MS，MiST评分≥0.75） HBx对PP2A复合物中STRN3/STRN4等调节亚基的替换 HBx诱导的Hippo和mTORC2通路激活（RICTOR pT1135，YAP表达） mTOR激酶抑制剂（如TAK-228）对YAP水平的影响 Rictor缺失对小鼠肝癌模型生存和YAP表达的影响
摘要
乙型肝炎病毒（HBV）感染通过诱导炎症和细胞应激促进肝癌的发生。尽管HBV对肿瘤发生主要具有间接作用，但HBV与HCC中复发性基因组表型相关，提示其影响已确立的HCC的生物学。对HBV与宿主蛋白相互作用及其对HCC发生和维持的机制性贡献的表征，可为HCC生物学提供见解，并揭示治疗脆弱点。在此，我们使用亲和纯化质谱法全面绘制了肝细胞癌（HCC）中HBV与人蛋白之间的145种物理相互作用网络。被HBV蛋白靶向的宿主因子亚群在非HBV相关HCC中优先突变，提示它们与HBV的相互作用影响HCC生物学。HBV与参与mRNA剪接、有丝分裂信号和DNA修复的蛋白质相互作用，后者与HBV癌蛋白X（HBx）相互作用。HBx通过从PP2A全酶中排除纹蛋白调节亚基来重塑PP2A磷酸酶复合物，且HBx对PP2A的作用导致Hippo激酶激活。同时，HBx激活mTOR复合物2（mTORC2），这可阻止YAP降解。在人HCC标本和小鼠HCC模型中观察到mTORC2介导的YAP上调，并可用mTOR激酶抑制剂靶向。因此，HBV与宿主蛋白的相互作用重连HCC信号，而非直接激活有丝分裂途径，为肿瘤促进病毒的细胞效应提供了另一种范式。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- HBV如何通过其蛋白与宿主蛋白的相互作用影响肝细胞癌（HCC）的生物学行为？
- 核心机制
- HBx蛋白通过替换PP2A全酶中的纹蛋白调节亚基来重塑PP2A复合物，导致Hippo激酶激活和YAP磷酸化降解；同时HBx激活mTORC2，mTORC2通过抑制YAP降解维持其水平，从而在HCC中协调YAP表达。
- 主要证据
- AP-MS揭示HBV-宿主蛋白互作网络；CRISPRi功能筛选显示PPP2CA和STRN3等敲低影响细胞增殖；磷酸化蛋白质组学和激酶活性分析显示HBx影响Hippo和mTORC2信号；细胞实验和Rictor敲除小鼠模型证实mTORC2调控YAP。
- 研究意义
- 该研究提供了HBV与HCC相互作用的全面图谱，并揭示HBV可能通过重塑PP2A和mTORC2信号产生可靶向的治疗弱点，为进一步开发针对HBV相关HCC的治疗策略提供了依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
HBV对HCC基因突变状态的影响分析
评估HBV感染对HCC中基因突变频率的影响。
使用TCGA LIHC队列的突变和拷贝数数据，通过贝叶斯逻辑回归分析HBV（或HCV）感染状态与基因突变频率的关联，鉴定差异突变基因。
网络传播整合互作组和基因组数据
整合HBV蛋白互作和差异突变数据，优先排序癌症相关的HBV相互作用。
将MiST评分和差异突变偏差分别传播到ReactomeFI参考网络，计算组合显著评分，以识别HBV影响的关键基因和通路。
CRISPRi功能筛选验证HBV相互作用蛋白
通过敲低HBV相互作用蛋白，评估其对HCC细胞增殖的影响。
在HUH7和Hep3B细胞中使用dCas9-KRAB CRISPRi系统敲低选定的HBV相互作用蛋白，通过实时显微镜监测细胞增殖。
HBx对PP2A复合物重塑的机制研究
阐明HBx如何改变PP2A全酶的组成。
在HUH7细胞中共表达Flag-PPP2CA和Strep-HBx，通过AP-MS比较PP2A相互作用蛋白的变化，并通过截短体定位HBx与PP2CA的结合区域。
HBx对PP2A下游信号通路的影响
检测HBx通过PP2A重塑对HCC信号通路（如Hippo和mTORC2）的影响。
利用磷酸化蛋白质组学和激酶活性分析（MIB/MS）评估HBx表达对激酶活性的影响，并通过Western blot验证Hippo和mTORC2关键蛋白的磷酸化和表达变化。
mTORC2对YAP调控的体外验证
验证mTORC2对YAP蛋白稳定性的调控作用。
使用mTORC1/mTORC2抑制剂（如TAK-228）处理HBx阳性或阴性的HCC细胞，检测YAP蛋白水平变化，并通过MG-132处理验证蛋白酶体依赖性降解。
mTORC2对YAP调控的体内验证
在动物模型中验证mTORC2对YAP的调控作用。
通过流体力学注射在Rictorfl/fl小鼠中敲除Rictor，同时表达AKT和Ras，观察肿瘤生长、生存期和YAP表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
蛋白相互作用鉴定
基因表达分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Invitrogen | -- |
| 胎牛血清 | Axenia BioLogIx | -- | |
| RPMI培养基 | -- | -- | |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| 潮霉素 | -- | -- | |
| 药物处理 | 依维莫司 | Selleckchem | -- |
| LB-100 | Selleckchem | -- | |
| MG-132 | Selleckchem | -- | |
| MK-2206 | Selleckchem | -- | |
| 冈田酸 | Selleckchem | -- | |
| TAK-228 | Selleckchem | -- | |
| AP-MS | FuGene 6转染试剂 | Promega | -- |
| Strep-Tactin微珠 | IBA Life Sciences | -- | |
| 脱硫生物素 | IBA Life Sciences | -- | |
| 银染试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 抗Flag-M2磁珠 | Sigma Aldrich | -- | |
| 质谱分析 | Thermo Scientific Velos Pro线性离子阱质谱系统 | Thermo Scientific | -- |
| Thermo Scientific Q Exactive混合四极杆Orbitrap质谱系统 | Thermo Scientific | -- | |
| Proxeon EASY nLC II高压液相色谱系统 | Thermo Scientific | -- | |
| 磷酸化蛋白质组学 | Q Exactive Orbitrap Plus质谱系统 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| Complete蛋白酶抑制剂 | -- | -- | |
| PhosStop磷酸酶抑制剂 | -- | -- | |
| Restore Western Blot剥离缓冲液 | Thermo Fisher | -- | |
| 抗体 | AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 9272 |
| Phospho-AKT S473抗体 | Cell Signaling Technology | 4060 | |
| GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 2118 | |
| ILK抗体 | Cell Signaling Technology | 3856 | |
| MOB抗体 | Cell Signaling Technology | 13730 | |
| Phospho-MOB T35抗体 | Cell Signaling Technology | 8699 | |
| PP2Ac抗体 | Cell Signaling Technology | 2038 | |
| 核糖体蛋白S6抗体 | Cell Signaling Technology | 2217 | |
| Phospho-Ribosomal protein S6 S240/244抗体 | Cell Signaling Technology | 2215 | |
| RICTOR抗体 | Cell Signaling Technology | 2140 | |
| Phospho-RICTOR T1135抗体 | Cell Signaling Technology | 3806 | |
| Yap抗体 | Cell Signaling Technology | 12395 | |
| Phospho-YAP S127抗体 | Cell Signaling Technology | 13008 | |
| Actin抗体 | Sigma-Aldrich | A2228 | |
| Flag抗体 | Sigma-Aldrich | F3165 | |
| Flag-HRP抗体 | Sigma-Aldrich | A8592 | |
| HBx抗体 | Abcam | ab2741 | |
| SMC5抗体 | Abcam | ab18038 | |
| Strep抗体 | Thermo Fisher Scientific | MA5–17282 | |
| RT-qPCR | Trizol试剂 | Invitrogen | -- |
| Superscript II逆转录试剂盒 | Invitrogen | -- | |
| 随机六聚体引物 | Roche | -- | |
| SYBR Green荧光染料 | -- | -- | |
| 免疫组化 | Ki67抗体 | Thermo Fisher Scientific | MA5–14520 |
| Vectastain Elite ABC试剂盒 | -- | -- | |
| 增殖检测 | BrdU细胞增殖试剂盒 | Exalpha | -- |
| 质粒构建 | pHR-SFFV-dCAS9-BFP-KRAB质粒 | Addgene | RRID:Addgene_46911 |
| pCRISPRia-v2质粒 | Addgene | RRID:Addgene_84832 | |
| pLVX-TetOne-Puro质粒 | Addgene | RRID:Addgene_171123 | |
| 1.3wt HBV构建体 | Addgene | RRID:Addgene_65462 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| AP-MS实验 | HUH7细胞，FuGene 6转染，Strep-Tactin beads，40小时收样，MiST评分阈值0.75 阅读提示：参照Materials and Methods中的Affinity Purification – Mass Spectrometry部分 |
| 差异突变分析 | TCGA LIHC队列，基因突变和拷贝数数据，Bayesian logistic regression模型，HBV/HCV感染状态 阅读提示：参照Materials and Methods中的Differential mutation analysis部分 |
| CRISPRi增殖实验 | HUH7和Hep3B细胞，dCas9-KRAB，每个基因3-5个sgRNA，培养120小时，Incucyte监测 阅读提示：参照Materials and Methods中的CRISPRi和细胞增殖部分 |
| PP2A复合物重塑分析 | HUH7细胞，共表达Flag-PPP2CA和Strep-HBx，AP-MS检测PP2A互作蛋白 阅读提示：参照Materials and Methods中的Affinity Purification – Mass Spectrometry部分及Figure 3相关描述 |
| mTORC2/YAP验证 | HCC细胞（SNU-182、SNU-449、SNU-423），药物处理（TAK-228、MG-132等），Western blot检测YAP 阅读提示：参照Materials and Methods中的细胞培养和药物处理部分，以及Results中mTORC2相关描述 |
| 体内动物实验 | Rictorfl/fl小鼠，流体力学注射Cre、AKT、Ras质粒，监测生存期和肿瘤生长 阅读提示：参照Materials and Methods中的Mouse models部分 |