应用ReSisTrace建立耐药特征
鉴定FLT3-ITD细胞中对FLT3抑制剂固有耐药或敏感的细胞谱系及其转录组特征
将MOLM-13细胞用谱系条形码文库转导，同步化后分成两份：一份进行scRNA-seq作为处理前样本，另一份用米哚妥林、quizartinib或DMSO处理72小时，恢复后scRNA-seq，鉴定耐药和敏感谱系，比较转录组获得耐药特征。
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单细胞谱系追踪揭示急性髓系白血病中FLT3抑制剂耐药特征及增敏策略
Single-Cell Lineage Tracing Uncovers Resistance Signatures and Sensitizing Strategies to FLT3 Inhibitors in Acute Myeloid Leukemia
实验完整度
高高，包含体外细胞系、原代患者样本、PDX小鼠模型等多层级，并有CRISPR敲除、Western blot、药物协同评分及体内生存分析等功能验证。
主要模型
MOLM-13细胞系（FLT3-ITD突变） MV4-11细胞系（FLT3-ITD突变） FLT3-ITD突变AML患者原代样本 FLT3-ITD阳性AML PDX小鼠模型
重点核对
药物处理浓度：米哚妥林100 nM，quizartinib 10 nM（体外） 协同实验中CC-90009预处理24小时，后加FLT3抑制剂作用72小时 PDX模型中quizartinib剂量10 mg/kg，CC-90009剂量5 mg/kg，每日给药 动物模型：NSG小鼠，6-10周龄，每组8只 患者样本培养条件：25% HS-5条件培养基与75% RPMI-1640混合
摘要
虽然FLT3抑制剂已显著改善了侵袭性FLT3突变急性髓系白血病（AML）的治疗，但耐药性的出现仍是一个主要挑战。在此，我们应用我们最近开发的单细胞谱系追踪方法ReSisTrace，在FLT3-ITD突变的AML中识别对FLT3抑制剂米哚妥林和quizartinib具有内在耐药或敏感的细胞。比较这些细胞的基因表达谱揭示了转录组耐药特征，包括GSPT1的上调。通过CRISPR-Cas9介导的敲除耗尽GSPT1，导致AML细胞对quizartinib治疗的敏感性增加。此外，在FLT3-ITD细胞系和原代AML患者样本中，用小分子CC-90009靶向GSPT1与FLT3抑制剂联合时表现出强烈的协同效应。此外，在FLT3-ITD阳性AML患者来源异种移植（PDX）小鼠模型中，CC-90009和quizartinib联合用药与任一单药相比，显示出显著更高的抗肿瘤疗效并延长了总生存期。此外，诱导与耐药特征相反的转录组变化的化合物促使细胞获得FLT3抑制剂敏感状态。Vistusertib（mTOR抑制剂）、linsitinib（IGF1R和胰岛素受体抑制剂）和meisoindigo（IGF1R和Src家族激酶抑制剂），均抑制致癌性FLT3信号传导下游或平行的通路，被预测并验证可使FLT3突变细胞系和原代细胞对FLT3抑制剂敏感。总的来说，这些发现证明了ReSisTrace在血液系统癌症中揭示治疗脆弱性的预先存在的转录特征，并阐明增强FLT3-ITD突变AML中FLT3抑制剂治疗效果的策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- FLT3-ITD突变急性髓系白血病中，是否存在预先存在的转录状态决定对FLT3抑制剂（米哚妥林和quizartinib）的耐药性，以及能否通过靶向这些状态来增强治疗效果？
- 核心机制
- 预先存在的转录耐药特征（如GSPT1上调）赋予细胞对FLT3抑制剂的耐药性；靶向GSPT1（如CC-90009降解）或抑制FLT3下游或平行通路（如mTOR、IGF1R/胰岛素受体、SRC激酶）可逆转耐药状态，增敏FLT3抑制剂。
- 主要证据
- 通过ReSisTrace单细胞谱系追踪比较耐药与敏感细胞转录组，鉴定出耐药特征；CRISPR敲除GSPT1增加quizartinib敏感性；CC-90009与FLT3抑制剂在细胞系、原代样本及PDX模型中协同抑瘤；预测药物（vistusertib、linsitinib、meisoindigo）在体外和原代样本中验证增敏。
- 研究意义
- 提供ReSisTrace方法在血液肿瘤中揭示固有耐药特征的应用，并识别可与FLT3抑制剂联合的增敏策略，有望预防耐药发生，提高FLT3-ITD突变AML的治疗效果。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证GSPT1在耐药中的作用
确定GSPT1是否介导对FLT3抑制剂的耐药性
通过CRISPR-Cas9敲除GSPT1，检测对quizartinib的敏感性；并使用Western blot验证CC-90009诱导GSPT1降解。
筛选并验证预测的增敏药物
寻找能诱导与耐药特征相反转录变化的化合物，增强FLT3抑制剂敏感性
基于L1000数据库计算耐药特征与药物扰动特征的负向连接分数，筛选出vistusertib、linsitinib、meisoindigo等，并在细胞系和原代样本中验证与FLT3抑制剂联合的协同效应。
在PDX小鼠模型中验证联合治疗效果
评估CC-90009与quizartinib联合的体内抗肿瘤疗效和生存获益
将FLT3-ITD阳性PDX细胞注射入NSG小鼠，分组给予vehicle、quizartinib、CC-90009或联合治疗，监测肿瘤负荷和生存期。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
单细胞谱系追踪和转录组分析
基因功能验证
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 药物处理 | 米哚妥林 | Selleckchem | -- |
| quizartinib | MedChemExpress | -- | |
| CC-90009 | MedChemExpress | -- | |
| ENOblock | MedChemExpress | -- | |
| vistusertib | MedChemExpress | -- | |
| linsitinib | ChemieTek | -- | |
| 甲异靛 | MedChemExpress | -- | |
| AZD5438 | Selleckchem | -- | |
| OTS167 | Selleckchem | -- | |
| 细胞转导 | 嘌呤霉素 | Santa Cruz Biotechnology | -- |
| 细胞同步化 | 胸苷 | Merck | -- |
| 药物处理 | 二甲基亚砜 | MP Biomedicals | -- |
| 单细胞RNA测序 | Chromium Next GEM 单细胞3'试剂盒v3.1 | 10x Genomics | -- |
| Chromium Next GEM芯片G单细胞试剂盒 | 10x Genomics | -- | |
| Dual Index Kit TT Set A | 10x Genomics | -- | |
| 测序 | NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Pierce蛋白酶抑制剂混合物 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 4–20% Mini-PROTEAN® TGX™预制蛋白胶 | Bio-Rad | -- | |
| Immobilon-FL PVDF膜 | Merck | -- | |
| GSPT1抗体 | Proteintech | 10763-1-AP | |
| α-微管蛋白抗体 | Abcam | ab7291 | |
| α-肌动蛋白抗体 | Merck | CP01 | |
| β-肌动蛋白抗体 | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| 细胞活力检测 | CellTiter-Glo 2.0检测 | Promega | -- |
| 细胞计数 | TC20自动细胞计数仪 | Bio-Rad | -- |
| 动物实验 | D-荧光素 | -- | -- |
| IVIS Spectrum成像系统 | PerkinElmer-Revvity | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| ReSisTrace实验 | MOLM-13细胞转导效率、条形码库、药物浓度（100 nM米哚妥林、10 nM quizartinib）、处理时间72小时、恢复时间（米哚妥林3天、quizartinib 4天、DMSO 7天）、细胞数量 阅读提示：Materials and methods: ReSisTrace experimental workflow |
| 药物联合实验 | 细胞密度（MOLM-13 600细胞/孔，MV4-11 800细胞/孔，原代样本7500细胞/孔）、药物预孵育24小时、联合孵育72小时、浓度范围（10%-50%抑制）、重复次数（三复孔，至少三次）、阳性对照100 μM苯扎氯铵、阴性对照0.2% DMSO 阅读提示：Materials and methods: Drug combination testing and synergy scoring |
| CRISPR-Cas9敲除 | gRNA序列、转导方法（800 x g离心2小时）、筛选时间（5天）、细胞密度（8000细胞/孔）、quizartinib浓度（1、2、2.5 nM）、处理时间72小时 阅读提示：Materials and methods: Generation of GSPT1-knockout cells |
| PDX小鼠模型 | NSG小鼠品系（JAX #005557）、年龄（6-10周）、每组8只、细胞注射数量（1x10^6）、给药途径（quizartinib口服，CC-90009皮下）、剂量（quizartinib 10 mg/kg，CC-90009 5 mg/kg）、给药频率（每日）、治疗周期（14天）、CC-90009提前一天开始 阅读提示：Materials and methods: In vivo testing of drug combination efficacy in an AML PDX mouse model |
| 原代样本培养 | 患者样本来源（芬兰血液注册与临床生物样本库）、培养条件（25% HS-5条件培养基+75% RPMI-1640，10% FBS，1%青霉素-链霉素，1% GlutaMAX）、培养时间（2-3小时）、单核细胞培养基（MCM）评估 阅读提示：Materials and methods: Patient sample processing |