CD36表达与TAM表型分析
验证CD36在肿瘤进展中的表达变化及其与免疫抑制表型的关联。
通过流式细胞术检测不同时间点YUMMER肿瘤中髓系细胞CD36表达，并分析CD36高表达TAMs的免疫抑制标志物（PD-L1、CD206、ARG1）表达。
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肿瘤相关巨噬细胞中的清道夫受体CD36通过抑制I型干扰素信号促进癌症进展
Scavenger Receptor CD36 in Tumor-Associated Macrophages Promotes Cancer Progression by Dampening Type-I IFN Signaling
实验完整度
高包含体外细胞实验、小鼠肿瘤模型、单细胞测序分析、功能验证及患者数据相关分析，多层证据验证CD36调控IFN-I机制。
主要模型
YUMMER1.7小鼠黑色素瘤模型 MC38小鼠结直肠癌模型 骨髓来源巨噬细胞（BMDM） 人类单核细胞来源巨噬细胞
重点核对
CD36在TAMs中的表达水平与肿瘤进展相关 CD36-cKO小鼠肿瘤生长显著减缓 CD36-cKO TAMs中I型干扰素相关基因和蛋白表达升高 IFNβ中和抗体或IFNAR1缺失可消除CD36-cKO的肿瘤抑制作用 p38抑制剂SB203580在WT中抑制肿瘤生长，但在CD36-cKO中无额外效果
摘要
肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）是决定肿瘤微环境（TME）炎症状态的异质性髓系细胞群体。在本研究中，我们揭示了清道夫受体CD36抑制TAM炎症状态的机制。CD36在TAMs中上调，并与免疫抑制特征相关，髓系特异性缺失CD36显著减少了肿瘤生长。此外，CD36缺陷的TAMs获得了炎症特征，包括I型干扰素（IFN-I）产生增加，这与癌症患者中观察到的CD36与IFN-I反应之间的负相关一致。由CD36缺陷TAMs产生的IFN-I，尤其是IFNβ，直接诱导肿瘤细胞静止并延缓肿瘤生长。机制上，CD36通过氧化脂质信号下游的p38激活，作为巨噬细胞中IFN-I信号的天然抑制因子。这些发现确立了CD36作为TAM功能和肿瘤炎症微环境的关键调节因子，为药理学抑制CD36以重振抗肿瘤免疫力提供了额外的理论依据。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CD36在肿瘤相关巨噬细胞中如何调控其炎症状态并影响肿瘤进展？
- 核心机制
- CD36通过结合氧化低密度脂蛋白（oxLDL）激活p38信号通路，抑制I型干扰素（特别是IFNβ）的产生，从而抑制TAMs的抗肿瘤炎症功能，促进肿瘤生长。
- 主要证据
- CD36-cKO小鼠肿瘤生长减缓，TAMs中IFNβ产生增加；IFNβ直接诱导肿瘤细胞静止；p38抑制剂恢复IFNβ产生并抑制肿瘤生长；人类患者数据中CD36与ISG表达负相关。
- 研究意义
- 本研究确立了CD36作为TAM功能和肿瘤炎症微环境的关键调节因子，为药理学抑制CD36以重振抗肿瘤免疫力提供了理论依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
CD36缺失对肿瘤生长的影响
评估髓系特异性缺失CD36是否影响肿瘤生长。
利用Cd36flox/floxCsf1r-Cre小鼠（CD36-cKO）和对照小鼠，皮下接种YUMMER或MC38肿瘤细胞，测量肿瘤体积。
单细胞转录组分析
揭示CD36缺失对TAMs转录组的影响，特别是干扰素相关通路。
重分析已发表的B16黑色素瘤单细胞测序数据（GSE171194），比较WT和Cd36−/− TAMs的差异表达基因和通路富集。
IFN-I产生和功能验证
验证CD36缺失是否导致IFN-I产生增加及其对肿瘤细胞增殖的影响。
通过qPCR和ELISA检测CD36-cKO TAMs中Ifnb1和IFNβ水平；使用Fucci细胞系检测IFNβ对肿瘤细胞周期的影响。
机制探究：oxLDL-CD36-p38通路
阐明CD36如何通过oxLDL和p38信号抑制IFN-I产生。
检测oxLDL结合CD36的能力、p38磷酸化水平，使用p38抑制剂SB203580处理动物，并验证其依赖IFNAR1。
人类样本相关性分析
评估CD36与I型干扰素反应在人类癌症患者中的相关性。
分析公共单细胞和TCGA数据集中CD36与ISG表达的相关性，以及CD36 TAM signature对生存的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| MEM非必需氨基酸 | -- | -- | |
| 肿瘤消化 | I型胶原酶 | Sigma-Aldrich | -- |
| 脱氧核糖核酸酶I | Roche | -- | |
| ACK裂解缓冲液 | Invitrogen | -- | |
| 流式细胞术 | LIVE/DEAD固定化紫色死细胞染色试剂盒 | Invitrogen | -- |
| eBioscience™ Foxp3/转录因子染色缓冲液 | Invitrogen | -- | |
| 布雷非德菌素A | BioLegend | -- | |
| 抗CD16/32抗体 | BioLegend | 101301 | |
| 抗CD45抗体 | BioLegend | 103147 | |
| 抗CD3ε抗体 | Thermo Fisher Scientific | 46-0032-82 | |
| 抗NK1.1抗体 | BioLegend | 108726 | |
| 抗CD4抗体 | BioLegend | 100406 | |
| 抗CD8a抗体 | BD Biosciences | 741811 | |
| 抗CD11b抗体 | BD Biosciences | 612801 | |
| 抗Ly6C抗体 | BD Biosciences | 563011 | |
| 抗Ly6G抗体 | BioLegend | 127624 | |
| 抗CD11c抗体 | BD Biosciences | 564080 | |
| 抗F4/80抗体 | BioLegend | 123118 | |
| 抗CD206抗体 | BioLegend | 141704 | |
| 抗PD-L1抗体 | BioLegend | 124321 | |
| 抗ARG1抗体 | Thermo Fisher Scientific | 17-3697-82 | |
| 抗TNF抗体 | BioLegend | 506305 | |
| 抗IL-1β（前体）抗体 | Thermo Fisher Scientific | 25-7114-82 | |
| 抗MHCII抗体 | BioLegend | 107624 | |
| 抗IFNAR1抗体 | Thermo Fisher Scientific | 12-5945-82 | |
| 抗IRF7抗体 | Fisher Scientific | 12-5829-82 | |
| 抗ISG15抗体 | Fisher Scientific | PA5-17461 | |
| 抗IFNβ1抗体 | Cell Signaling Technology | 97450 | |
| 抗兔IgG (H+L) F(ab')2片段（Alexa Fluor® 647偶联物） | Cell Signaling Technology | 4414 | |
| BMDM生成 | 巨噬细胞集落刺激因子 | Gibco | PMC2044 |
| StemPro™ Accutase™细胞解离试剂 | Gibco | A1110501 | |
| 基因编辑 | Cas9核酸酶 | IDT | 1081059 |
| Lonza P3原代细胞4D-Nucleofector™ X试剂盒 | Lonza | V4XP-3032 | |
| western blot | P38 MAPK (D13E1)抗体 | Cell Signaling Technology | 8690S |
| 人巨噬细胞生成 | MojoSort™人泛单核细胞分离试剂盒 | Biolegend | 480059 |
| 人巨噬细胞集落刺激因子 | Biolegend | 574804 | |
| 蛋白提取 | RIPA裂解缓冲液 | Thermo Scientific | 89900 |
| 蛋白定量 | Micro BCA蛋白测定试剂盒 | Thermo Scientific | 23235 |
| 细胞因子检测 | 小鼠细胞因子/趋化因子44-Plex Discovery Assay® Array (MD44) | Eve Technologies | -- |
| 小鼠IFN-β ELISA试剂盒，高灵敏度 | PBL Assay Science | 42410 | |
| 巨噬细胞富集 | EasySep™小鼠CD11b阳性选择试剂盒II | Stemcell Technologies | 18970 |
| oxLDL结合实验 | 氧化LDL摄取检测试剂盒（oxLDL-DyLight™-488） | Cayman Chemical | 601180 |
| oxLDL功能实验 | 人高氧化低密度脂蛋白 | Kalen Biomedical | 770252-7 |
| RNA提取 | RLT Plus缓冲液 | Qiagen | 1053393 |
| RNeasy Plus小型试剂盒 | Qiagen | 74134 | |
| cDNA合成 | Maxima H Minus双链cDNA合成试剂盒 | Thermo Scientific | : |
| qPCR | SsoAdvanced™通用SYBR® Green Supermix | Bio-rad | : |
| Western Blot | 磷酸化p38 MAPK (Thr180/Tyr182)抗体 | Cell Signaling Technology | 9211 |
| p38 MAPK (D13E1) XP兔单抗 | Cell Signaling Technology | 8690 | |
| Cofilin (D3F9) XP兔单抗 | Cell Signaling Technology | 5175 | |
| 山羊抗兔IgG (H+L)二抗，HRP | Thermo Fisher Scientific | 31460 | |
| 病毒包装 | pBOB-EF1-FastFUCCI-Puro慢病毒载体 | -- | -- |
| psPAX2包装质粒 | -- | -- | |
| pMD2.G包膜质粒 | Sigma | -- | |
| 慢病毒感染 | LentiBOOST™慢病毒转导增强剂 | Sirion Biotech | SB-P-LV-101-01 |
| 基因编辑 | Lonza SF细胞系4D-Nucleofector™ X试剂盒 | Lonza | V4XC-2032 |
| 药物处理 | SB203580（p38抑制剂） | Selleck Chemicals | S1076 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 肿瘤模型构建 | 细胞系（YUMMER1.7和MC38）的来源和培养条件；接种细胞数（YUMMER 2.5×10^5，MC38 5×10^5）；接种方式（皮下注射）；肿瘤测量时间点（每3-4天，从第7天开始）。 阅读提示：Materials and Methods: Cell lines and tumor engraftment |
| CD36-cKO小鼠 | 小鼠品系（Cd36flox/flox和Csf1r-Cre）的遗传背景；Cre介导的敲除效率（尤其在TAMs中）。 阅读提示：Materials and Methods: Mice |
| TAMs分离与分析 | 肿瘤消化酶（胶原酶I和DNase I）浓度；消化时间（30分钟）；流式抗体克隆和稀释度。 阅读提示：Materials and Methods: Tumor digestion and Flow cytometry |
| BMDM生成 | M-CSF浓度（25 ng/ml）；培养时间（7天）；细胞解离方法。 阅读提示：Materials and Methods: Generation of bone marrow-derived macrophage |
| oxLDL处理 | oxLDL浓度（50 μg/ml）；孵育时间（30分钟）；CD36抑制剂SSO浓度（100 μM）。 阅读提示：Materials and Methods: Oxidized low density lipoprotein (oxLDL) binding and functional assays |
| p38抑制剂处理 | SB203580剂量（10 mg/kg）；给药方式（口服灌胃）；给药频率（每日一次）；给药起始时间（第8天）。 阅读提示：Materials and Methods: In vivo monoclonal antibody and drug treatment |
| IFNβ中和抗体处理 | 抗IFNβ抗体剂量（200 μg/次）；给药途径（腹腔注射）；给药频率（每3-4天）；开始时间（接种后第7天）。 阅读提示：Materials and Methods: In vivo monoclonal antibody and drug treatment |
| Fucci细胞周期分析 | Fucci载体（pBOB-EF1-FastFUCCI-Puro）；细胞株（MC38-Fucci和YUMMER-Fucci）；体内分析时间点（第10天）。 阅读提示：Materials and Methods: Generation of Fucci and Ifnar1−/− cancer cell lines; Results and Figure 5 |