CAF亚型鉴定与功能分析
鉴定前列腺癌中不同CAF亚型及其标志物和功能特征。
整合四个前列腺癌scRNA-seq数据集，聚类分析得到六个CAF簇，通过差异表达和功能富集鉴定出ECM-CAF（CD248+）和Lym-CAF（TSG6+），并通过FACS分选后进行RNA-seq验证。
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YAP1抑制诱导前列腺癌中癌症相关成纤维细胞向肿瘤抑制表型转化
YAP1 Inhibition Induces Phenotype Switching of Cancer-Associated Fibroblasts to Tumor Suppressive in Prostate Cancer
实验完整度
高整合scRNA-seq、RNA-seq、类器官模型、体外共培养、多种体内肿瘤模型及治疗实验，并进行功能验证和机制验证（包括Co-IP、双荧光素酶报告基因等）。
主要模型
前列腺癌组织样本及scRNA-seq数据集（37例样本） 前列腺癌细胞系RM-1、22Rv1、Tramp-C1 小鼠同系移植瘤模型（C57BL/6） 人源化免疫重建NCG小鼠模型
重点核对
CAF亚型诱导条件：TGFβ（20 ng/mL）诱导ECM-CAF，TNFα/IFNγ（各20 ng/mL）诱导Lym-CAF，处理48小时 YAP1沉默使用siRNA（两种序列）或他莫昔芬诱导的Cd248-CreERT2;Yap1flox/flox条件敲除小鼠 体内实验使用RM-1或Tramp-C1细胞（1×10^5或1×10^6）与CAF或基质细胞混合皮下注射 抗PD-1抗体（10 mg/kg）在第7、10、13、16、19天腹腔注射 流式细胞术分析CD8+ T细胞浸润和活化标志物（CD25、CD69、Granzyme B、IFNγ）
摘要
前列腺癌很少对免疫检查点阻断疗法产生反应。癌症相关成纤维细胞是免疫学“冷”肿瘤微环境的关键组成部分，被认为是增强免疫治疗反应的潜在靶点。本研究旨在揭示调控CAF可塑性的机制，以确定将CAF从促肿瘤表型转化为抗肿瘤表型并增强前列腺癌ICB疗效的策略。整合四个前列腺癌单细胞RNA测序数据集定义了促肿瘤和抗肿瘤CAF，RNA-seq、流式细胞术和前列腺癌类器官模型证明了两种CAF亚型的功能。细胞外基质相关CAF促进胶原沉积和癌细胞进展，淋巴细胞相关CAF表现出抗肿瘤表型并诱导CD8+ T细胞的浸润和活化。YAP1活性调控ECM-CAF表型，YAP1沉默促进向Lym-CAF的转化。NF-κB p65是Lym-CAF亚型的核心转录因子，YAP1抑制p65的核转位。体内选择性敲除ECM-CAF中的YAP1可促进CD8+ T细胞浸润和活化，并增强抗PD-1治疗对前列腺癌的治疗效果。总之，本研究揭示了前列腺癌中调控CAF身份的机制，并强调了一种通过改变CAF亚型来抑制肿瘤生长和提高ICB敏感性的治疗策略。意义：YAP1调节癌症相关成纤维细胞表型，可作为靶点将癌症相关成纤维细胞从促进细胞外基质沉积的促肿瘤亚型转变为刺激抗肿瘤免疫和免疫治疗疗效的肿瘤抑制亚型。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 前列腺癌中CAF可塑性的调控机制是什么，以及能否通过靶向CAF亚型转化来增强免疫检查点阻断疗效？
- 核心机制
- YAP1通过直接结合IKKα并抑制其磷酸化，从而抑制NF-κB p65的核转位，维持ECM-CAF表型；YAP1沉默则解除对NF-κB p65的抑制，促进CAF向Lym-CAF转化，增强CD8+ T细胞活化。
- 主要证据
- 整合scRNA-seq和RNA-seq鉴定出ECM-CAF和Lym-CAF；体外诱导和共培养实验证明Lym-CAF通过NF-κB p65促进CD8+ T细胞活化；类器官实验和体内条件敲除模型验证YAP1缺失促进CAF表型转化、抑制肿瘤生长并增强抗PD-1疗效。
- 研究意义
- 靶向YAP1将促肿瘤CAF转化为抗肿瘤CAF可能是一种提高前列腺癌免疫检查点阻断疗效的治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
CAF亚型体外诱导与验证
验证TGFβ或TNFα/IFNγ能否分别诱导ECM-CAF和Lym-CAF表型。
从患者前列腺癌组织分离原代CAF，分别用TGFβ（20 ng/mL）或TNFα/IFNγ（各20 ng/mL）刺激48小时，通过qPCR检测标志基因表达。
CAF亚型体内功能验证
评估ECM-CAF和Lym-CAF对肿瘤生长和CD8+ T细胞浸润的影响。
将RM-1细胞与预诱导的CAF混合皮下注射到C57BL/6小鼠，测量肿瘤生长、重量，并通过流式细胞术分析CD8+ T细胞浸润和活化标志物。
类器官共培养实验
验证ECM-CAF对肿瘤类器官生长的促进作用以及YAP1敲低的影响。
将人前列腺癌类器官与i-ECM-CAF（siCON或siYAP1）共培养，测量类器官直径，并通过qPCR检测ECM相关基因。
YAP1调控CAF表型转化的机制研究
阐明YAP1调控ECM-CAF与Lym-CAF之间表型转化的分子机制。
在诱导的Lym-CAF中过表达YAP1或沉默YAP1，检测标志基因；通过Western blot、免疫荧光、双荧光素酶报告基因和Co-IP检测YAP1与IKKα的相互作用及对NF-κB通路的影响。
体内选择性YAP1敲除实验
验证在ECM-CAF中特异性敲除YAP1对肿瘤生长和免疫微环境的影响。
使用Cd248-CreERT2;Yap1flox/flox（cKO）小鼠，通过他莫昔芬诱导YAP1敲除，然后接种RM-1或Tramp-C1肿瘤细胞，观察肿瘤生长、CD8+ T细胞浸润和胶原沉积。
抗PD-1联合治疗实验
评估ECM-CAF中YAP1敲除与抗PD-1抗体联合治疗的效果。
在cKO小鼠接种RM-1肿瘤后第7天开始给予抗PD-1抗体（10 mg/kg）或同型对照，在第7、10、13、16、19天腹腔注射，比较肿瘤生长和免疫指标。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| RPMI-1640培养基 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| DMEM/F12培养基 | Gibco | -- | |
| 细胞因子诱导 | 转化生长因子β | -- | -- |
| 肿瘤坏死因子α | -- | -- | |
| 干扰素γ | -- | -- | |
| 细胞培养 | 人CD3+ T细胞分选试剂盒 | BioLegend | 480022 |
| CD3/CD28磁珠 | Gibco | 11161 | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | 11668019 |
| 动物实验 | 他莫昔芬 | MCE | HY13757 |
| D-荧光素 | MCE | HY12591 | |
| 抗小鼠PD-1抗体 | Bio X Cell | BE0146 | |
| 小鼠IgG1 κ同型对照抗体 | Bio X Cell | BE0083 | |
| 流式细胞术 | 可固定活力染料 | BioLegend | 423105 |
| 流式细胞术分选 | 抗EPCAM-APC抗体 | Invitrogen | 17579182 |
| 抗CD31-PE抗体 | BioLegend | 303105 | |
| 抗CD45-Pacific Blue抗体 | BioLegend | 304021 | |
| 抗CD248一抗 | BioLegend | 949902 | |
| 抗TSG6一抗 | Abcam | ab267469 | |
| FITC标记二抗 | Abcam | ab6717 | |
| 免疫印迹 | 抗YAP1抗体 | Proteintech | 13584-1-AP |
| 免疫沉淀 | 抗IKKα抗体 | Abcam | ab32041 |
| 人IgG | Proteintech | 30000-0-AP | |
| ELISA | 人CXCL9 ELISA试剂盒 | Abcam | ab219047 |
| 人CXCL10 ELISA试剂盒 | Abcam | ab83700 | |
| 人CXCL11 ELISA试剂盒 | Abcam | ab289695 | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | -- | -- |
| RT-qPCR | PrimeScript RT预混液 | TaKaRa | RR036A |
| SYBR Green预混液试剂盒 | YEASEN | 11201ES | |
| 类器官培养 | II型胶原酶 | -- | -- |
| Y27632 | -- | -- | |
| 基质胶 | -- | -- | |
| 组织芯片 | 前列腺癌组织芯片 | SuperBiotec | PRC1601 |
| 成像 | 小动物活体成像系统 | PerkinElmer | -- |
| 显微镜 | ZEISS激光扫描显微镜900 | ZEISS | -- |
| 试剂 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CAF亚型诱导 | 细胞因子种类和浓度（TGFβ 20 ng/mL，TNFα和IFNγ各20 ng/mL），处理时间（48小时），基础培养基（DMEM/F12+10% FBS） 阅读提示：见Materials and Methods下的“Cell culture, the induction of ECM-CAF, and Lym-CAF” |
| 肿瘤移植模型 | 细胞系和数量（RM-1 1×10^5，22Rv1 5×10^5，Tramp-C1 1×10^6），混合基质细胞数量（3×10^5），注射体积（100 μL），小鼠品系和性别（C57BL/6或NCG，雄性） 阅读提示：见Materials and Methods下的“Tumor xenograft, bioluminescence imaging, and ICB treatment” |
| YAP1条件敲除 | 他莫昔芬给药方案（120 mg/kg/天，连续5天，腹腔注射），Cre品系（Cd248-CreERT2），Yap1flox/flox小鼠 阅读提示：见Materials and Methods下的“Tumor xenograft, bioluminescence imaging, and ICB treatment”和Figure 5A |
| CD8+ T细胞分析 | 流式抗体面板（CD45、CD8、CD25、CD69、Granzyme B、IFNγ、PD-1、CTLA4），染色条件（4°C 30分钟），设门策略 阅读提示：见Materials and Methods下的“Flow cytometry and fluorescence-activated cell sorting”及补充表S3 |
| 抗PD-1治疗 | 抗体剂量（10 mg/kg），给药途径（腹腔注射），给药时间（第7、10、13、16、19天），同型对照抗体 阅读提示：见Materials and Methods下的“Tumor xenograft, bioluminescence imaging, and ICB treatment”和Figure 6A |
| 分子机制验证 | siRNA序列（YAP1和NF-κB p65），转染浓度（10 nmol/L），处理时间（48小时），Co-IP抗体（YAP1、IKKα），双荧光素酶报告基因检测条件 阅读提示：见Materials and Methods下的“Cell transfection, coculture model of CAFs with CD3+ lymphocytes”和“Coimmunoprecipitation” |