转录组和染色质图谱分析
描述ASPS肿瘤和模型的转录组和表观遗传特征，识别富集的通路。
对ASPS肿瘤、PDX和细胞系进行RNA-seq、ATAC-seq和H3K27ac ChIP-seq，并与GIST等其他肉瘤比较。
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ASPSCR1::TFE3通过诱导可靶向的转录程序驱动腺泡状软组织肉瘤
ASPSCR1::TFE3 Drives Alveolar Soft Part Sarcoma by Inducing Targetable Transcriptional Programs
实验完整度
高包含多层级证据：体外细胞实验（dTAG降解、CRISPR、药物处理）、体内PDX和细胞系异种移植模型、患者样本转录组和染色质分析，以及功能验证和机制验证。
主要模型
ASPS-1细胞系 ASPS-KY细胞系 FU-UR-1细胞系 ASPS PDX异种移植模型 ASPS-1/Cas9异种移植模型
重点核对
ASPS-1、ASPS-KY、FU-UR-1细胞系均验证携带ASPSCR1::TFE3融合 dTAG13处理ASPS-KYdTAG/sgTFE3细胞用于急性降解ASPSCR1::TFE3 palbociclib处理浓度5 nM起抑制ASPS细胞增殖 ASPS PDX和ASPS-1/Cas9异种移植模型用于体内药效评估 CDK4/6和VEGFR联合抑制显著降低肿瘤体积
摘要
腺泡状软组织肉瘤（ASPS）是一种罕见的间叶性恶性肿瘤，由ASPSCR1::TFE3融合驱动。更好地了解这种致癌转录调节因子驱动癌症生长的机制，有助于确定潜在的治疗靶点。在此，我们表征了ASPS肿瘤和临床前模型的转录和染色质景观，确定了ASPSCR1::TFE3通过调节参与细胞增殖、血管生成和线粒体生物学的核心转录程序，在肿瘤细胞活力中的关键作用。ASPSCR1::TFE3在增强子和启动子处与关键表观遗传调节因子直接相互作用，以支持ASPS相关的转录。在ASPSCR1::TFE3驱动的效应程序中，细胞增殖由高水平的细胞周期蛋白D1表达驱动。破坏细胞周期蛋白D1/CDK4信号导致ASPS增殖能力丧失，CDK4/6和血管生成联合抑制在异种移植模型中阻止了肿瘤生长。这些结果定义了ASPS致癌程序，揭示了ASPSCR1::TFE3控制肿瘤生物学的机制，并确定了治疗靶向肿瘤细胞内在脆弱性的策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- ASPSCR1::TFE3融合蛋白如何驱动ASPS的肿瘤生长，以及哪些可靶向的效应机制可被用于治疗？
- 核心机制
- ASPSCR1::TFE3直接结合大量活性染色质区域，与BRD4、Mediator复合物、转录起始复合物等表观遗传调节因子相互作用，驱动细胞增殖、血管生成和线粒体生物学的转录程序，并抑制肌源性分化。其中细胞增殖依赖于高表达的细胞周期蛋白D1/CDK4。
- 主要证据
- 通过RNA-seq、ATAC-seq、ChIP-seq和BioID等实验证实ASPSCR1::TFE3的调控作用；dTAG降解实验和CRISPR敲除证实其必要性；palbociclib和sunitinib在体外和体内异种移植模型中验证了靶向Cyclin D1/CDK4和血管生成的效果。
- 研究意义
- 该研究揭示了ASPSCR1::TFE3在ASPS中的致癌机制，并确定了CDK4/6和血管生成联合抑制作为治疗ASPS的潜在策略，为化疗难治性ASPS提供了新的治疗机会。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
鉴定ASPSCR1::TFE3基因组结合位点
确定融合蛋白在基因组上的结合位置及其与活性染色质的关系。
在ASPS-KY细胞中进行HA标记的ASPSCR1::TFE3 ChIP-seq，并分析与H3K27ac的共定位。
急性降解ASPSCR1::TFE3
验证融合蛋白对细胞活力和转录组的必要性，并识别其直接调控的基因。
利用dTAG系统快速降解ASPSCR1::TFE3，观察细胞增殖停止、细胞周期阻滞和形态变化，并进行RNA-seq和ATAC-seq。
鉴定ASPSCR1::TFE3相互作用蛋白
确定融合蛋白的相互作用网络，揭示其调控转录的分子机制。
使用BioID技术结合质谱鉴定与ASPSCR1::TFE3邻近的蛋白，并进行功能验证（sgRNA敲除和抑制剂处理）。
抑制Cyclin D1/CDK4信号
验证Cyclin D1/CDK4作为ASPSCR1::TFE3驱动的关键靶点。
使用palbociclib处理ASPS细胞系和异种移植模型，评估细胞增殖、细胞周期和肿瘤生长。
体内联合治疗评估
评估CDK4/6和VEGFR抑制剂联合治疗对ASPS肿瘤生长的效果。
在ASPS-1/Cas9异种移植模型中，分别或联合给予palbociclib和sunitinib，监测肿瘤体积。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| L-谷氨酰胺 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| X-tremeGene转染试剂 | Roche | 6365809001 | |
| 慢病毒生产 | pMD2.G质粒 | Addgene | 12259 |
| psPAX2质粒 | Addgene | 12260 | |
| 慢病毒转导 | 聚凝胺 | -- | -- |
| 药物处理 | 帕博西尼 | LC Laboratories | P-7788 |
| 舒尼替尼 | LC Laboratories | S-8803 | |
| NU9056 | MedChemExpress | HY-110127 | |
| JQ1 | Selleck Chemicals | S7110 | |
| THZ1 | Selleck Chemicals | S7549 | |
| 星形孢菌素 | TargetMol Chemicals | T6680 | |
| dTAG13 | Tocris | 6605 | |
| 流式细胞术 | Guava easyCyte流式细胞仪 | Luminex Corporation | -- |
| 碘化丙啶 | Life Technologies | P1304MP | |
| 核糖核酸酶A | Thermo Fischer Scientific | EN0531 | |
| 凋亡检测 | Guava Nexin试剂 | Luminex Corporation | 4500-0450 |
| RT-qPCR | Rneasy小型试剂盒 | Qiagen | 74106 |
| SuperScript IV VILO cDNA合成试剂盒 | Invitrogen | 11766050 | |
| Power SYBR Green PCR预混液 | Life Technologies | 4367659 | |
| QuantStudio 6 Flex实时荧光定量PCR系统 | Thermo Fischer Scientific | -- | |
| RNA-seq | Rneasy Plus试剂盒 | Qiagen | 74136 |
| NEBNext Ultra II DNA文库制备试剂盒 | New England Biolabs | E7645S | |
| NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- | |
| ChIP-seq | H3K27ac抗体 | Abcam | ab4729 |
| HA抗体 | Cell Signaling Technology | 3724 | |
| Dynabeads蛋白A磁珠 | Life Technologies | 10002D | |
| AMPureXP磁珠 | Beckman Coulter | A63881 | |
| Qubit双链DNA高灵敏度检测试剂盒 | Life Technologies | Q32854 | |
| ThruPLEX DNA测序试剂盒 | Takara Bio | R400675 | |
| NextSeq 500测序仪 | Illumina | -- | |
| NovaSeq X Plus测序仪 | Illumina | -- | |
| ATAC-seq | Zymo Research标签化试剂盒 | Zymo Research | D5458 |
| 免疫印迹 | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | 11873580001 | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Pierce Biotechnology | 23225 | |
| HA抗体 | Cell Signaling Technology | 2367 | |
| TFE3抗体 | Cell Signaling Technology | 14779 | |
| GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 5174 | |
| Rb抗体 | Cell Signaling Technology | 9309 | |
| pRb抗体 | Cell Signaling Technology | 8516 | |
| E2F1抗体 | Cell Signaling Technology | 3742 | |
| 细胞周期蛋白D1抗体 | Cell Signaling Technology | 55506 | |
| CDK4抗体 | Cell Signaling Technology | 12790 | |
| CDK1抗体 | Cell Signaling Technology | 9116 | |
| HIF1A抗体 | Cell Signaling Technology | 36169 | |
| Cas9抗体 | Cell Signaling Technology | 19526 | |
| 链霉亲和素-辣根过氧化物酶 | Abcam | ab7403 | |
| Odyssey CLx红外成像系统 | LI-COR Biosciences | -- | |
| 化学发光底物 | MilliporeSigma | WBKLS0500 | |
| BioID | 链霉亲和素-琼脂糖磁珠 | GE Healthcare | 17-5113-01 |
| 质谱 | LTQ Orbitrap Velos Pro离子阱质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 动物实验 | Ki-67抗体 | Cell Signaling Technology | 9027 |
| 免疫组织化学 | HRP标记二抗 | Cell Signaling Technology | 8114 |
| DAB底物 | Cell Signaling Technology | 8059 | |
| NovaRed底物 | Vector Laboratories | SK-4800 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源和培养条件：ASPS-1、ASPS-KY、FU-UR-1细胞系；DMEM培养基、10%FBS、2mM L-谷氨酰胺、100μg/ml青霉素和链霉素 阅读提示：Materials and Methods - Cell Culture and Virus Production |
| 药物处理 | 药物浓度和处理时间：palbociclib（5-500 nM）、sunitinib（40 mg/kg）、dTAG13（500 nM）、JQ1、THZ1等 阅读提示：Materials and Methods - Cell Culture and Virus Production; Figure legends |
| CRISPR/Cas9基因敲除 | sgRNA靶向序列（靶向ASPSCR1::TFE3、CCND1、CDK4等），Cas9表达载体（Addgene #73310），转导方法（spinoculation），筛选标记（blasticidin） 阅读提示：Materials and Methods - Cell Culture and Virus Production; Results |
| dTAG降解实验 | dTAG系统构建：ASPS-KY细胞中敲除内源性TFE3/ASPSCR1并表达dTAG标记的ASPSCR1::TFE3救援构建；dTAG13处理浓度和时间（500 nM，0-72小时） 阅读提示：Materials and Methods - Cell Culture and Virus Production; Results - ASPSCR1::TFE3 acutely controls |
| 体内药效评估 | ASPS PDX和ASPS-1/Cas9异种移植模型；给药方案：palbociclib 100 mg/kg和/或sunitinib 40 mg/kg灌胃，5天/周；治疗时长（3天或21天）；肿瘤体积测量方法 阅读提示：Materials and Methods - Xenograft Models and Immunohistochemistry; Results - Effects of palbociclib |