体外模型建立与TGF-β表达验证
确定致癌性CALR（CALRdel52和CALRins5）是否诱导TGF-β表达。
在32D和Ba/F3细胞中表达MPL及CALR突变体（CALRins5或CALRdel52），通过微阵列分析、流式检测L-TGF-β1蛋白水平，并利用TGF-β启动子荧光素酶报告基因检测转录活性。
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致癌钙网蛋白通过刺激骨髓微环境中的TGFβ表达和调节性T细胞扩增诱导免疫逃逸
Oncogenic Calreticulin Induces Immune Escape by Stimulating TGFβ Expression and Regulatory T-cell Expansion in the Bone Marrow Microenvironment
实验完整度
高包含体外细胞系实验、小鼠模型（移植模型及基因敲入）、患者样本分析及多个独立队列验证，并有功能验证（TGF-β中和、T细胞耗竭）和机制验证（信号通路抑制剂、转录因子分析）。
主要模型
32D细胞和Ba/F3细胞（表达MPL及CALR突变） 小鼠原发性骨髓移植模型（CALRdel52-MPL） JAK2V617F基因敲入小鼠 患者来源iPSC分化的红系祖细胞及MPN患者骨髓样本
重点核对
CALRdel52或JAK2V617F驱动MPN小鼠模型中TGF-β1表达及Treg频率的变化 抗TGF-β抗体处理（10mg/kg，腹腔注射，移植后第12,16,20天）对生存和T细胞代谢/细胞因子的影响 T细胞耗竭（anti-CD4和anti-CD8，250μg起始，每周一次）对TGF-β中和效应的逆转 JAK1/2抑制剂鲁索替尼、PI3K抑制剂（Buparlisib, Pictilisib）、ERK抑制剂（Ulixertinib）和Sp1抑制剂（Plicamycin）对TGF-β表达的影响 TGF-β1对T细胞穿孔素和TNF-α产生以及Treg分化的体外影响（浓度及时间）
摘要
越来越多的证据支持致癌突变与免疫逃逸机制之间的相互作用。 counteract 致癌信号介导的免疫逃逸的策略可能为各种恶性肿瘤患者提供改进的治疗选择。由于突变型钙网蛋白（CALR）是骨髓增殖性肿瘤（MPN）的常见驱动因素，我们分析了致癌性CALRdel52对MPN骨髓（BM）微环境的影响。单细胞RNA测序显示，在小鼠MPN模型中，CALRdel52导致产生转化生长因子（TGF）-β1的红系祖细胞扩增，并促进FoxP3+调节性T细胞（Treg）的扩增。使用抗TGF-β抗体治疗改善了小鼠的存活率，并在体内增加了CD4+和CD8+ T细胞的糖酵解活性，而T细胞耗竭则消除了中和TGF-β所提供的保护作用。在体外，TGF-β1降低了T细胞产生穿孔素和肿瘤坏死因子（TNF）-α的能力。CALRdel52细胞产生TGF-β1依赖于JAK1/2、PI3K和ERK活性，这些活性激活转录因子Sp1以诱导TGF-β1表达。在四个独立的患者队列中，与健康个体相比，MPN患者骨髓中的TGF-β1表达增加，且MPN患者骨髓中Treg的频率高于健康个体。总之，本研究确定了CALRdel52 MPN中的ERK/Sp1/TGF-β1轴作为一种免疫抑制机制，可以靶向该轴以引发T细胞介导的细胞毒性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 致癌性钙网蛋白（CALRdel52）如何影响骨髓微环境中的免疫逃逸？其潜在机制及治疗靶点是什么？
- 核心机制
- CALRdel52通过JAK1/2、PI3K和ERK信号通路激活转录因子Sp1，进而上调TGF-β1表达；TGF-β1抑制T细胞效应功能并促进Treg扩增，导致免疫逃逸。
- 主要证据
- 单细胞RNA测序显示CALRdel52小鼠骨髓中产生TGF-β1的红系祖细胞和Treg扩增；抗TGF-β抗体改善小鼠生存，T细胞耗竭消除其保护作用；体外TGF-β1降低T细胞穿孔素和TNF-α产生并诱导Treg；患者样本中TGF-β1和Treg频率增加。
- 研究意义
- 靶向CALRdel52-TGF-β1轴可增强T细胞活性和糖酵解能力，为在MPN患者中开展TGF-β拮抗剂的临床试验提供了理论依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
小鼠模型构建与单细胞转录组分析
在体内验证CALRdel52对骨髓微环境及TGF-β表达的影响。
将表达MPL和CALRdel52或空载体的原代骨髓细胞移植到经亚致死剂量照射的BALB/c小鼠中，21天后分离骨髓进行单细胞RNA测序分析细胞组成和TGF-β表达。
TGF-β中和治疗及T细胞功能评估
评估TGF-β在CALRdel52介导的免疫抑制中的功能作用。
对携带CALRdel52-MPL骨髓的小鼠给予抗TGF-β1,2,3中和抗体或同型对照，监测生存；通过SCENITH分析T细胞代谢，流式检测TNF-α产生；部分小鼠进行CD4/CD8 T细胞耗竭以验证T细胞依赖性。
体外T细胞效应与Treg分化分析
确证TGF-β对T细胞功能及Treg分化的直接影响。
从小鼠脾脏分离T细胞，用CD3/CD28激活珠激活，在有无TGF-β1的条件下培养，检测穿孔素、颗粒酶B、TNF-α表达以及CD25+Foxp3+Treg频率。
信号通路机制研究
阐明CALRdel52诱导TGF-β表达的分子机制。
在32D-MPL-CALRdel52细胞中，使用JAK1/2抑制剂（鲁索替尼）、PI3K抑制剂（Buparlisib, Pictilisib）、MEK抑制剂（Selumetinib, Trametinib）、ERK抑制剂（Ulixertinib）、STAT3抑制剂及Sp1抑制剂（Plicamycin）处理，检测L-TGF-β1表达和TGF-β启动子活性；并通过Western blot验证ERK磷酸化。
患者样本验证
验证CALRdel52驱动的TGF-β上调在人类MPN中的相关性。
分析MPN患者骨髓样本中TGF-β1表达和Treg频率，包括患者来源iPSC分化的红系祖细胞、Freiburg队列、公共数据库GSE174060和GSE214361。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
验证机制链路
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | Gibco | -- |
| RPMI 1640培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 细胞因子 | 小鼠干细胞因子 | Peprotec | -- |
| 小鼠白细胞介素-3 | Peprotec | -- | |
| 小鼠白细胞介素-6 | Peprotec | -- | |
| 病毒转导 | 聚凝胺 | Sigma-Aldrich | -- |
| 药物处理 | 鲁索替尼 | 文中未明确说明 | -- |
| 布帕利西布 | Selleckchem | -- | |
| 匹克替利西布 | MedChem Express | -- | |
| 司美替尼 | MedChem Express | -- | |
| 曲美替尼 | Selleckchem | -- | |
| 乌利昔替尼 | Selleckchem | -- | |
| STAT3抑制剂VI | Calbiochem | -- | |
| 普卡霉素 | MedChem Express | -- | |
| AP-1抑制剂 (T-5224) | MedChem Express | -- | |
| Elk-1抑制剂 (TAT-DEF-Elk) | MedChem Express | -- | |
| CREB抑制剂 (666-15) | MedChem Express | -- | |
| FOXO1抑制剂 (AS1842856) | MedChem Express | -- | |
| NF-κB抑制剂 (JSH-23) | MedChem Express | -- | |
| 抗体治疗 | 抗小鼠TGFβ1,2,3体内抗体 | -- | -- |
| 小鼠IgG1同型对照 | -- | -- | |
| T细胞耗竭 | 抗小鼠CD4体内抗体 | -- | -- |
| 抗小鼠CD8体内抗体 | -- | -- | |
| 大鼠IgG2b同型对照 | -- | -- | |
| 细胞分离 | Pan T细胞分离试剂盒II | Miltenyi Biotec | 130-095-130 |
| T细胞激活 | 小鼠T细胞激活剂CD3/CD28磁珠 | Gibco | 11456D |
| 细胞分离 | 淋巴细胞分离液 | anprotec | -- |
| iPSC分化 | 基质胶 | Corning | -- |
| 甲基纤维素 | StemCell Technologies | -- | |
| 免疫细胞化学 | 抗磷酸化STAT3 Tyr705抗体 | Cell Signaling | -- |
| 山羊抗兔IgG (H+L) AlexaFluorPlus647二抗 | Invitrogen | -- | |
| DAPI | -- | -- | |
| 荧光素酶报告实验 | pGL3-TGFb1载体 | Addgene | 101762 |
| pGL4.73(hRluc/SV40)载体 | Promega | E6911 | |
| 转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | 11668019 |
| 荧光素酶报告实验 | Dual-Glo荧光素酶检测系统 | Promega | E2920 |
| Spark 10M多功能酶标仪 | Tecan | -- | |
| 流式细胞术 | LIVE/DEAD固定化死细胞染色试剂盒 | Molecular Probes | -- |
| LIVE/DEAD固定化Aqua死细胞染色试剂盒 | Thermo Scientific | -- | |
| 人Fc受体阻断液 | Miltenyi Biotec | -- | |
| True Stain FcX | BioLegend | -- | |
| 固定/破膜试剂盒 | BD Bioscience | -- | |
| Foxp3/转录因子染色缓冲液套装 | eBioscience | 00-5523-00 | |
| SCENITH | 2-脱氧-D-葡萄糖 | Sigma | -- |
| 寡霉素 | Sigma | 1404-19-9 | |
| O-炔丙基嘌呤霉素试剂 | -- | -- | |
| Click-iT Plus OPP Alexa Fluor 647蛋白质合成检测试剂盒 | Invitrogen | C10458 | |
| RNA提取 | RNeasy小量提取试剂盒 | Qiagen | 74104 |
| miRNeasy小量提取试剂盒 | Qiagen | -- | |
| cDNA合成 | High Capacity cDNA逆转录试剂盒 | Applied Biosystems | -- |
| qPCR | LightCycler 480 SYBR Green I预混液 | Roche | -- |
| LightCycler 480实时荧光定量PCR仪 | Roche | -- | |
| scRNA-seq | Chromium Next GEM单细胞3'试剂盒v3.1 | 10x Genomics | -- |
| Chromium控制器 | 10x Genomics | -- | |
| Veriti 96孔热循环仪 | Applied Biosystems | -- | |
| 2200 TapeStation | Agilent Technologies | -- | |
| 微阵列 | GeneChip WT PLUS试剂盒 | Applied Biosystems | 902280 |
| Affymetrix Clariom S芯片 | Affymetrix | -- | |
| 蛋白提取 | RIPA裂解液 | Santa Cruz Biotechnology | -- |
| 磷酸酶抑制剂混合物2 | Sigma-Aldrich | 1861281 | |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Scientific | -- |
| Western blot | NuPAGE Bis-Tris 4-12%梯度胶 | Invitrogen | -- |
| PVDF转印膜，0.45 μm | Thermo Scientific | -- | |
| WesternBright Quantum HRP底物 | Advansta | -- | |
| ChemoStar M6成像系统 | Intas Science Imaging Instruments GmbH | -- | |
| 血细胞分析 | HORIBA Scil Vet ABC血液分析仪 | HORIBA | -- |
| 细胞培养 | 嘌呤霉素 | InvivoGen | ant-pr-1 |
| 杀稻瘟菌素S盐酸盐 | Sigma Aldrich | 15205 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠模型 | 小鼠品系、年龄、性别、照射剂量、移植细胞数量、观察时间点 阅读提示：Methods: Mice, Viral transduction and primary BM MPN model |
| TGF-β中和治疗 | 抗TGF-β抗体剂量、给药途径、给药时间点 阅读提示：Methods: Anti-TGFβ and cell depletion treatment |
| T细胞耗竭 | 抗CD4/CD8抗体剂量、给药频率、开始时间 阅读提示：Methods: Anti-TGFβ and cell depletion treatment |
| 体外TGF-β处理 | TGF-β浓度、处理时间、T细胞激活条件 阅读提示：Results: TGF-β induces regulatory T cells in vitro...; Figure 4 legend；Methods: Culture of primary cells |
| 信号通路抑制剂处理 | 抑制剂名称、浓度、处理时间、细胞状态 阅读提示：Methods: Starvation and inhibitor treatment of cell lines; Figure 5,6 legends |
| 患者样本分析 | 患者队列纳入标准、样本类型、健康对照匹配 阅读提示：Methods: Human tissue analysis and patients; Results: BM cells derived from patients... |