CRISPR-Cas9全基因组筛选鉴定MEK抑制增敏基因
鉴定在RAS突变神经母细胞瘤中敲除后可增强MEK抑制剂敏感性的基因。
在SK-N-AS细胞中感染Avana-4 sgRNA文库，经DMSO或3 nM trametinib处理，比较sgRNA丰度变化，通过STARS算法分析。
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CDK8抑制的转录拮抗作用提高MEK抑制剂的治疗效果
Transcriptional Antagonism by CDK8 Inhibition Improves Therapeutic Efficacy of MEK Inhibitors
实验完整度
高包含CRISPR全基因组筛选、体外细胞系验证、体内异种移植模型、RNA-seq转录组分析等多个独立证据层级，并有功能验证和机制验证。
主要模型
RAS突变神经母细胞瘤细胞系SK-N-AS、KP-N-SI9s NF1缺失神经母细胞瘤细胞系SK-N-FI、GI-M-EN ALK突变神经母细胞瘤细胞系KELLY、SK-N-SH RAS突变肺癌细胞系NCI-H23、胰腺癌细胞系CFPAC-1
重点核对
SK-N-AS细胞系（NRAS Q61K突变）用于CRISPR筛选和机制研究 trametinib浓度3 nM用于体外实验 selumetinib体内给药剂量25 mg/kg，每日两次 BI-1347体内给药剂量10 mg/kg，每日一次 CDK8抑制效果通过pSTAT1 S727磷酸化水平验证
摘要
异常的RAS/MAPK信号传导是肿瘤发生的常见驱动力，可通过临床批准的MEK抑制剂进行靶向治疗。然而，单药MEK抑制剂治疗时疾病进展很常见，联合治疗通常需要取得晚期癌症的显著临床获益。这里我们专注于在具有激活RAS/MAPK信号通路突变的神经母细胞瘤中鉴定基于MEK抑制剂的联合治疗，这些突变在诊断时罕见，但在复发神经母细胞瘤中频繁发生。部署了一项全基因组CRISPR-Cas9功能基因组筛选，以鉴定当被敲除时使RAS突变神经母细胞瘤对MEK抑制敏感的基因。CCNC或CDK8（介体激酶模块的两个成员）的缺失使神经母细胞瘤对MEK抑制敏感。此外，CDK8的小分子激酶抑制剂在体外和体内改善了RAS突变神经母细胞瘤和其他成人实体瘤对MEK抑制剂的反应。转录谱显示，CDK8或CCNC的缺失拮抗了MEK抑制诱导的转录特征。当联合时，CDK8或CCNC的缺失阻止了MEK抑制诱导的原生长基因表达的补偿性上调。这些发现为RAS突变神经母细胞瘤提出了一种新的治疗组合，并可能对其他RAS驱动的恶性肿瘤具有临床意义。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 在RAS突变神经母细胞瘤中，哪些基因的缺失能够增强MEK抑制剂的疗效，以及其潜在机制是什么？
- 核心机制
- CDK8或CCNC缺失通过拮抗MEK抑制诱导的转录适应，阻止促生长基因表达程序的上调，从而增强MEK抑制剂的抗肿瘤效果。
- 主要证据
- CRISPR筛选鉴定CCNC和CDK8为敏化基因；体外细胞增殖实验、体内异种移植模型验证CDK8抑制剂联合MEK抑制剂疗效；RNA-seq和GSEA分析表明CDK8/CCNC缺失与MEK抑制诱导的转录变化相反。
- 研究意义
- 提出CDK8抑制剂联合MEK抑制剂作为RAS突变神经母细胞瘤的潜在治疗策略，并可能对其他RAS驱动的恶性肿瘤具有临床意义。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证CCNC或CDK8基因敲除对MEK抑制的增敏作用
验证CCNC或CDK8敲除是否在多个RAS突变神经母细胞瘤细胞系中增强MEK抑制剂的敏感性。
通过CRISPR-Cas9敲除CCNC或CDK8，进行群体倍增实验和剂量反应曲线，观察联合处理对细胞增殖的影响。
评估CDK8小分子抑制剂与MEK抑制剂联合的体外效果
评估CDK8激酶抑制剂是否能模拟基因敲除效果，并在体外增强MEK抑制剂的抗增殖作用。
使用CDK8抑制剂BI-1347和JH-XII-136处理多个细胞系，检测细胞活力、细胞周期、MEK和CDK8靶点抑制情况。
体内异种移植模型验证联合治疗疗效
评估CDK8抑制剂和MEK抑制剂联合在体内对RAS突变神经母细胞瘤的治疗效果。
将SK-N-AS细胞皮下植入裸鼠，待肿瘤长至一定大小后随机分组，给予载体、BI-1347、selumetinib或联合治疗，监测肿瘤体积和生存期。
转录组分析揭示CDK8/CCNC缺失对MEK抑制转录适应的拮抗作用
探究CDK8或CCNC缺失增强MEK抑制剂敏感性的分子机制。
对sgLACZ、sgCCNC、sgCDK8敲除的SK-N-AS细胞经DMSO或trametinib处理后进行RNA-seq，分析差异表达基因和基因集富集。
验证联合治疗在其他RAS通路激活的神经母细胞瘤及实体瘤中的效果
确定CDK8和MEK抑制联合是否在其他RAS通路突变或野生型细胞系中有效。
测试NF1缺失、ALK突变和RAS野生型的神经母细胞瘤细胞系，以及RAS突变肺癌和胰腺癌细胞系对联合治疗的反应。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| RPMI培养基 | -- | -- | |
| IMDM培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 胰岛素-转铁蛋白-硒 | -- | -- | |
| 药物处理 | 曲美替尼 | Selleck Chemicals | -- |
| 司美替尼 | Selleck Chemicals | -- | |
| BI-1347 | Boehringer Ingelheim | -- | |
| JH-XII-136 | -- | -- | |
| CRISPR基因敲除 | pLenti-CRISPRv2载体 | Addgene | 52961 |
| 细胞活力检测 | CellTiter-Glo发光检测试剂盒 | PerkinElmer | -- |
| 蛋白质印迹 | Cell Signaling裂解缓冲液 | Cell Signaling Technology | 9803 |
| 蛋白酶抑制剂 | Roche | 11836170001 | |
| 磷酸酶抑制剂 | Roche | 04906845001 | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Pierce | -- | |
| CDK8抗体 | Cell Signaling Technology | 4106 | |
| CCNC抗体 | Bethyl | A301989AM | |
| pSTAT1 S727抗体 | Cell Signaling Technology | 8826 | |
| STAT1抗体 | Cell Signaling Technology | 9176 | |
| GAPDH抗体 | Santa Cruz | sc-47724 | |
| ERK抗体 | Cell Signaling Technology | 4696 | |
| pERK抗体 | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| 二抗 | Licor | 926-68070, | |
| RNA提取 | RNeasy Plus Mini试剂盒 | Qiagen | 74134 |
| RNA测序 | ERCC RNA加标混合物 | ThermoFisher | 4456740 |
| 细胞周期分析 | Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647流式细胞术检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | C10424 |
| 碘化丙啶 | Cell Signaling Technology | 4087 | |
| 支原体检测 | MycoAlert支原体检测试剂盒 | Lonza | -- |
| 细胞计数 | Countess II自动细胞计数器 | Thermo Fisher | -- |
| 流式细胞术 | BD FACSCelesta流式细胞仪 | BD | -- |
| 蛋白质印迹成像 | Licor Odyssey成像系统 | Licor | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CRISPR筛选 | 细胞系：SK-N-AS；trametinib浓度：3 nM；处理时间：7和15天；重复数：3个重复；筛选阈值：STARS分数绝对值>2.5，调整后P<0.01 阅读提示：请参阅Methods中的'CRISPR Cas-9 Drug Modifier Screen and Analysis'和Results中的'Genome-scale CRISPR-Cas9 screen identifies sensitizers to MEK inhibition' |
| 药物处理 | trametinib剂量：3 nM；selumetinib剂量：250 nM（体外）；BI-1347剂量：10 nM（体外） 阅读提示：请参阅Methods中的'Drug Response Curves'和Results中的'CDK8 inhibitors improve response to MEK inhibition in RAS-mutant neuroblastoma cell lines' |
| 细胞增殖实验 | 接种密度：250,000或125,000细胞/孔；抑制剂浓度：文中未明确说明（需查看具体实验）；观察时间：每3-4天计数 阅读提示：请参阅Methods中的'Population Doubling Assay' |
| 体内实验 | 细胞接种量：1.0e6 cells；动物品系：裸鼠；selumetinib剂量：25 mg/kg，每日两次，口服；BI-1347剂量：10 mg/kg，每日一次，口服；肿瘤起始体积：90-200 mm3 阅读提示：请参阅Methods中的'In Vivo Therapeutic Studies' |
| 转录组分析 | 细胞系：SK-N-AS；敲除：sgLACZ、sgCCNC、sgCDK8；处理：DMSO或3 nM trametinib，处理4天；重复数：3个重复 阅读提示：请参阅Methods中的'RNA-sequencing'和'RNA-Seq Analysis' |