自体肿瘤单细胞图谱
绘制KPCT小鼠PDAC肿瘤的细胞状态图谱，识别经典、基底和间充质状态。
对15只肿瘤小鼠的tdTomato+癌细胞进行scRNA-seq，获得14,392个细胞，通过无监督聚类和伪时间分析确定细胞状态连续体。
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胰腺导管腺癌模型的系统比较鉴定出一个保守的高可塑性基底细胞状态
Systematic Comparison of Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Models Identifies a Conserved Highly Plastic Basal Cell State
实验完整度
高研究包含单细胞转录组、单细胞ATAC-seq、多种移植模型、谱系示踪及免疫荧光验证，证据层级丰富。
主要模型
KPCT小鼠模型 KPF; Rosa26mTmG/+; Lgr5CreER/CreER小鼠模型 2D细胞培养 3D类器官培养 原位移植模型（NSG和F1小鼠）
重点核对
小鼠品系：KPCT (KrasLSL-G12D/+; Trp53flox/flox; Pdx1-Cre; Rosa26LSL-tdTomato/+) 细胞分选：FACS分选tdTomato+癌细胞（CD45/CD31/CD11b/TER119阴性） 原位移植：将10,000个未分选细胞、10,000个FACS分选的tdTomato+细胞或200,000个2D/3D培养细胞（8代后）植入胰腺尾部 谱系示踪：对他莫昔芬（200 mg/kg，口服灌胃）处理后的KPF; Lgr5CreER/CreER; RosamTmG/+小鼠在3天和10天收获肿瘤 scRNA-seq：10x Genomics Chromium平台，目标捕获20,000-25,000个细胞
摘要
瘤内异质性和细胞可塑性已成为癌症的标志，包括胰腺导管腺癌（PDAC）。由于PDAC预后不良，更好地理解PDAC细胞多样性背后的机制至关重要。在此，我们利用单细胞基因组学研究了PDAC癌细胞在一系列体外和体内生长条件下的细胞异质性。异质性在2D和3D细胞培养模型中显著收缩，但在原位移植后恢复。原位移植可重复地获得自体PDAC肿瘤中鉴定的细胞状态，包括一种展现上皮和间充质基因共表达和共同可及性的基底状态。谱系示踪结合单细胞转录组学揭示基底细胞在体内表现出高可塑性。这项工作定义了细胞生长条件对表型多样性的影响，并揭示了一个高可塑性细胞状态，该状态具有促进状态转变和促进PDAC瘤内异质性的能力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 不同的PDAC模型系统（2D培养、3D类器官、原位移植）在多大程度上重现自体肿瘤的细胞状态异质性，以及基底细胞状态是否具有可塑性？
- 核心机制
- 基底细胞状态处于上皮-间充质轴的过渡状态，共表达上皮和间充质基因，并具有双价染色质状态；Lgr5+基底细胞在体内可分化为经典或间充质状态，表明基底状态赋予高可塑性。
- 主要证据
- 通过scRNA-seq和scATAC-seq分析自体KPCT肿瘤及多种原位移植模型，发现体外培养异质性降低，移植后恢复；谱系示踪结合scRNA-seq显示Lgr5+基底细胞在10天内扩散到经典和间充质状态。
- 研究意义
- 该研究确定了体内模型对重建PDAC细胞状态异质性的必要性，并揭示基底细胞状态可能作为治疗靶点以抑制可塑性和肿瘤进展。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
原位移植模型建立
比较不同移植方式（肿瘤碎片、未分选细胞、分选细胞、2D/3D培养细胞）对细胞状态异质性的影响。
将不同来源的肿瘤材料原位植入NSG或F1小鼠胰腺尾部，移植后通过超声监测，收获肿瘤并进行scRNA-seq。
体外培养模型分析
评估2D和3D培养条件下的细胞状态异质性。
从KPCT肿瘤建立2D和3D培养细胞系，进行scRNA-seq，发现体外培养异质性显著降低。
scATAC-seq分析
探究基底状态的染色质可及性特征。
对自体KPCT肿瘤进行scATAC-seq，发现基底细胞在经典和间充质基因位点具有共同可及性。
谱系示踪实验
追踪Lgr5+基底细胞的分化命运。
使用KPF; Lgr5CreER/CreER; RosamTmG/+小鼠，通过他莫昔芬诱导GFP标记Lgr5+细胞，在不同时间点进行scRNA-seq和免疫荧光分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 肿瘤消化 | IV型胶原酶 | ThermoFisher Scientific | 17104019 |
| 中性蛋白酶 | Corning | 354235 | |
| 脱氧核糖核酸酶I | Sigma Aldrich | 69182-3 | |
| 大豆胰蛋白酶抑制剂 | Sigma Aldrich | T9003 | |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| 流式分选 | APC偶联抗小鼠CD45抗体 | BD Biosciences | 559864 |
| APC偶联抗小鼠CD31抗体 | BD Biosciences | 561814 | |
| APC偶联抗小鼠CD11b抗体 | BD Biosciences | 561690 | |
| APC偶联抗小鼠TER-119抗体 | BD Biosciences | 561033 | |
| 小鼠BD Fc受体阻断剂 | BD Biosciences | 553142 | |
| 细胞培养 | Advanced DMEM/F12培养基 | Gibco | -- |
| Glutamax补充剂 | Invitrogen | -- | |
| B27补充剂 | Invitrogen | -- | |
| N-乙酰-L-半胱氨酸 | Sigma | -- | |
| Noggin重组蛋白 | Peprotech | -- | |
| 表皮生长因子 | Peprotech | -- | |
| 胃泌素 | Sigma | -- | |
| 成纤维细胞生长因子10 | Preprotech | -- | |
| 烟酰胺 | Sigma | -- | |
| 基质胶（生长因子减少型） | BD | -- | |
| 单细胞测序 | 10x Genomics Chromium平台 | 10x Genomics | -- |
| Dynabeads MyOne SILANE磁珠 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| 单细胞ATAC-seq | 细胞核缓冲液 | 10x Genomics | 2000153 |
| Chromium Chip E单细胞ATAC试剂盒 | 10x Genomics | 1000086 | |
| Chromium i7多重引物试剂盒N，Set A | 10x Genomics | 1000084 | |
| 组织学 | RFP抗体 | ChromTech | 6g6 |
| GFP抗体 | Abcam | ab5450 | |
| 波形蛋白抗体 | Abcam | ab92547 | |
| 细胞角蛋白17抗体 | Cell Signaling | 4543 | |
| 半乳糖凝集素-4抗体 | Thermo Scientific | PA5-34913 | |
| RNAscope 2.5 HD检测试剂盒 | ACD | 322360 | |
| 原位杂交 | Hs-Lgr5探针 | ACD | 312178 |
| 动物实验 | 他莫昔芬 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | 小鼠品系：KPCT (KrasLSL-G12D/+; Trp53flox/flox; Pdx1-Cre; Rosa26LSL-tdTomato/+) 和 KPF; Lgr5CreER/CreER; RosamTmG/+；年龄：7-8周（KPCT） 阅读提示：Methods: Animal Studies |
| 肿瘤消化和细胞分选 | 消化酶：胶原酶IV (0.1 U/ml)，Dispase (0.6 U/ml)，DNase I (10 U/ml)，大豆胰蛋白酶抑制剂 (0.1 mg/ml)；消化时间：42分钟；分选标记：CD45/CD31/CD11b/TER119阴性，tdTomato阳性 阅读提示：Methods: Isolation of tumor cells |
| 细胞培养 | 2D培养：Advanced DMEM/F12 + 10% FBS；3D培养：Matrigel + 添加因子（EGF, FGF10, Noggin等）；传代次数：8代 阅读提示：Methods: Cell culture and reagents |
| 原位移植 | 宿主：NSG或F1小鼠；细胞数：10,000未分选或分选，或200,000培养细胞；植入部位：胰腺尾部 阅读提示：Methods: Orthotopic models |
| 谱系示踪 | 他莫昔芬剂量：200 mg/kg口服；时间点：3天和10天 阅读提示：Methods: Lineage-tracing |
| 单细胞测序 | 目标细胞数：20,000-25,000；平台：10x Genomics Chromium；测序深度：NovaSeq S4 (R1 28, i7 8, R2 90 cycles) 阅读提示：Methods: Droplet-based scRNA-seq |