建立 CTC 异种移植模型
验证从患者血液中分离的 CTC 能否在免疫缺陷小鼠中形成原发肿瘤并自发转移至骨、脑、肝、淋巴结。
从乳腺癌患者（BR16）血液中分离 CTC，体外扩增后注射入 NSG 小鼠乳腺脂肪垫，观察肿瘤生长和转移形成。
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体内CRISPR筛选鉴定转移性进展的逐步遗传依赖性
An In Vivo CRISPR Screen Identifies Stepwise Genetic Dependencies of Metastatic Progression
实验完整度
高包含体内CRISPR筛选、体外细胞实验、异种移植模型、药物处理及临床数据关联分析，证据层级多样。
主要模型
BR16 CTC异种移植模型（CDX） MDA-MB-231-LM2 细胞系
重点核对
BR16 CDX 模型注入 NSG 小鼠乳腺脂肪垫，剂量为 1×10^6 细胞 CRISPR 筛选使用 GeCKOv2 文库，感染复数 MOI=0.3 PLK1 抑制剂 BI2536 静脉注射剂量 40 mg/kg，每周连续两天，共一或两个周期 belinostat 腹腔注射剂量 80 mg/kg，每周连续五天，共三个周期 rhosin 腹腔注射剂量 20 mg/kg，每天一次，共三周
摘要
乳腺癌的血源性转移涉及一系列严格调控的连续步骤，包括原发肿瘤病灶的生长、循环肿瘤细胞（CTC）的血管内渗，以及在不同远处转移部位的适应。在生理相关背景下，由于缺乏能够忠实重现人类乳腺癌生物学、生长动力学和趋向性的实验模型，调控这些步骤的基因知之甚少。在这里，我们在新建立的CTC异种移植模型中进行了体内功能缺失型CRISPR筛选，该模型能够自发模拟人类疾病，并确定了转移过程每一步的特异性遗传依赖性。验证实验揭示了对已有抑制剂（如PLK1抑制剂）的敏感性，可阻止CTC的血管内渗。总之，这些发现提供了一种新工具，用于重新分类参与人类癌症扩散的驱动基因，为理解转移生物学提供了见解，并为测试靶向治疗方法铺平了道路。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 在生理相关模型中，哪些基因在乳腺癌转移级联的各个步骤（原发肿瘤生长、CTC 血管内渗、器官特异性转移）中起关键作用？
- 核心机制
- PLK1 是 CTC 血管内渗所必需的，其缺失不影响原发肿瘤生长或肺转移定植，但显著减少 CTC 的释放；HDAC 和 Rho GTPases 的抑制可减少脑转移的生长。
- 主要证据
- 体内 CRISPR 筛选在 CTC 异种移植模型中鉴定出多项基因缺失；通过 minipool 筛选和个体 sgRNA 验证；PLK1 抑制剂处理减少 CTC；belinostat 和 rhosin 处理减少脑转移。
- 研究意义
- 提供了 CTC 来源的异种移植模型结合 CRISPR 筛选的新工具，可用于重新分类驱动基因，并为靶向治疗提供潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体内全基因组 CRISPR 筛选
在生理相关模型中鉴定影响原发肿瘤生长、CTC 产生和器官特异性转移的基因。
用表达 Cas9-GFP 的 BR16 细胞转导 GeCKOv2 文库，注入 NSG 小鼠乳腺脂肪垫，22-28 周后分离原发肿瘤、单 CTC、CTC 簇和转移器官，进行 sgRNA 深度测序。
基因敲除验证 CTC 簇形成基因
验证筛选出的候选基因（IL18R1, ITGA2, CSNK1A1L, CSNK2A2 等）是否影响 CTC 簇的形成和转移。
在 BR16 和 LM2 细胞中单独敲除候选基因，体外测量簇大小，体内注入小鼠测量 CTC 和转移负担。
验证 PLK1 对 CTC 血管内渗的作用
验证 PLK1 是否特异性地影响 CTC 的血管内渗，而不影响原发肿瘤生长或转移定植。
在 LM2 细胞中敲除 PLK1，注入小鼠乳腺脂肪垫，测量 CTC 数量、转移负担；尾静脉注射 PLK1 敲除细胞评估肺定植；PLK1 抑制剂 BI2536 处理评估 CTC 释放。
器官特异性转移基因鉴定与验证
鉴定与特定器官（骨、脑、肝、淋巴结）转移相关的基因，并验证抑制这些基因对脑转移的影响。
分析比较各器官中 sgRNA 耗竭情况，确定器官特异性基因；在颅内注射模型中用 HDAC 抑制剂（belinostat）和 Rho GTPases 抑制剂（rhosin）处理，观察脑转移生长。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| CTC 捕获 | Parsortix GEN3D6.5 细胞分离卡 | Angle Europe | -- |
| 细胞培养 | DMEM 培养基 | Invitrogen | 11330-057 |
| 胎牛血清 | Invitrogen | 10500064 | |
| RPMI-1640 培养基 | Invitrogen | 52400-025 | |
| B27 补充剂 | Invitrogen | 17504-044 | |
| 重组人 HER2 | Gibco | PHG0313 | |
| 重组人 FGF | Gibco | 100-18B | |
| 超低吸附六孔板 | Corning | 3471-COR | |
| 病毒包装 | hGeCKOa 和 hGeCKOb 质粒库 | Addgene | 1000000049 |
| pMDLG 包装质粒 | Addgene | 12251 | |
| pMD2G 包膜质粒 | Addgene | 12259 | |
| pRSV-Rev 包装质粒 | Addgene | 12253 | |
| 氯化钙 | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| 氯喹 | Sigma-Aldrich | C6628 | |
| Steriflip-GP 过滤器 | Sigma-Aldrich | Z660493 | |
| 筛选 | 嘌呤霉素 | Invivogen | ant-pr-1 |
| RNA提取 | RNeasy 小型试剂盒 | Qiagen | 74104 |
| RT-qPCR | 脱氧核糖核酸酶I | Promega | M6101 |
| SuperScript II 逆转录酶 | Thermo Fisher Scientific | 18064014 | |
| SYBR Green PCR 预混液 | Invitrogen | 4367659 | |
| 簇大小测量 | Hoechst 34580 染料 | Invitrogen | H21486 |
| 四甲基罗丹明甲酯 | Invitrogen | T668 | |
| TOTO-3 染料 | Invitrogen | T3604 | |
| 小鼠实验 | Cultrex 低生长因子基底膜提取物 | R&D Biosystems | 3533-010-02 |
| BI2536（PLK1 抑制剂） | MCE | -- | |
| 贝利司他（HDAC 抑制剂） | MCE | -- | |
| Rhosin（Rho GTPases 抑制剂） | MCE | -- | |
| 流式分离 | BD Influx 细胞分选仪 | BD Biosciences | -- |
| gDNA 提取 | 蛋白酶 K | Qiagen | 19131 |
| 核糖核酸酶 A | Qiagen | 19101 | |
| QIAmp DNA 微量试剂盒 | Qiagen | 56304 | |
| 测序 | Phusion Flash 高保真预混液 | Thermo Fisher Scientific | F548L |
| QIAquick 凝胶回收试剂盒 | Qiagen | 28706 | |
| Illumina NextSeq 500 测序仪 | Illumina | -- | |
| 免疫荧光 | 抗 Cas9 抗体 | BioLegend | 844301 |
| 抗人细胞角蛋白抗体 | Milteny Biotec | 130-112-931 | |
| 抗层粘连蛋白抗体 | Novus Biologicals | NB300-144 | |
| 抗 CD31 抗体 | R&D Systems | AF3628 | |
| 抗 Ki67 抗体 | Invitrogen | 14-5698-82 | |
| 抗 GFAP 抗体 | Invitrogen | PA1-10019 | |
| Cy3 偶联二抗 | Jackson ImmunoResearch | 712-165-153 | |
| 细胞染色 | DAPI 染料 | -- | -- |
| Prolong Gold 封片剂 | -- | -- | |
| 抗 Ki67 抗体 | Abcam | ab15580 | |
| 抗裂解型 Caspase-3 抗体 | Cell Signaling Technology | CS9664S | |
| 抗 EpCAM 抗体 | Cell Signaling Technology | 5198 | |
| 抗波形蛋白抗体 | Abcam | ab92547 | |
| Alexa Fluor 647 二抗 | Thermo Fisher Scientific | A-31573 | |
| 膜联蛋白 V | -- | -- | |
| 成像 | Operetta 高内涵成像系统 | PerkinElmer | -- |
| IVIS Lumina II 小动物成像系统 | PerkinElmer | -- | |
| Leica TCS SP8 共聚焦显微镜 | Leica | -- | |
| Leica DMI4000 倒置显微镜 | Leica | -- | |
| 测序 | PhiX 对照 DNA | Illumina | -- |
| 流式分析 | CytoFLEX 流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- |
| 细胞培养 | ARIAIII 流式细胞分选仪 | BD Biosciences | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CTC 异种移植模型建立 | BR16 CTC 细胞数量（1×10^6），注射部位（乳腺脂肪垫），小鼠品系（NSG），观察时间（22-28周） 阅读提示：Methods: Mouse experiments; Results: Generation and characterization of CTC-derived xenografts |
| 体内 CRISPR 筛选 | 文库（GeCKOv2），MOI=0.3，转导细胞数量（1×10^7/只），小鼠数量（70只），样本采集时间（22-28周） 阅读提示：Methods: Genome-wide sgRNA library transduction; Results: In vivo loss-of-function screen |
| 基因敲除验证 | 细胞系（BR16-Cas9-GFP-A2 和 LM2-Cas9-GFP-C32），sgRNA 数量（每基因2个），体外簇大小测量条件（Hoechst, TMRM, TOTO-3 染色），体内注射细胞数（1×10^6） 阅读提示：Methods: Individual knockout of candidate genes; Methods: Cluster size measurement; Results: Loss-of-function of IL18R1... |
| 候选基因体内验证 | 敲除细胞系（LM2-Cas9-GFP-C32），注射细胞数（1×10^6），PLK1 尾静脉注射细胞数（2×10^5），BI2536 剂量（40 mg/kg，静脉注射，每周连续两天，共两周期） 阅读提示：Methods: Mouse experiments; Results: PLK1 is required for intravasation |
| 脑转移药物处理 | 颅内注射细胞类型和数量（MDA-MB-231-GFP-Luc 2×10^5 或 BR16-RFP-Luc 4.5×10^5），belinostat 剂量（80 mg/kg，腹腔注射，每周连续五天，共三周），rhosin 剂量（20 mg/kg，腹腔注射，每天一次，共三周） 阅读提示：Methods: Mouse experiments; Results: CTC metastatic signature correlates with decreased MFS |