体内输卵管电穿孔递送质粒
验证通过电穿孔将Cre和CRISPR质粒递送至输卵管远端上皮细胞的效率。
向4-6周龄Rosa-LSL-tdTomato小鼠输卵管管腔注射含有Cre和CRISPR质粒的溶液，进行电穿孔，通过检测RFP表达评估递送效率。
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结合体内输卵管电穿孔与CRISPR-Cas9介导的基因组编辑建立高级别浆液性卵巢癌模型
Modeling High-Grade Serous Ovarian Carcinoma Using a Combination of In Vivo Fallopian Tube Electroporation and CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing
实验完整度
高包含体内动物模型、组织病理学、全基因组测序和单细胞RNA测序等多个独立证据层级，并进行了功能验证和机制验证。
主要模型
Lkb1完整小鼠（Lkb1flox/flox; Rosa-LSL-tdTomato） Lkb1缺失小鼠（Lkb1flox/flox; Rosa-LSL-tdTomato） 小鼠输卵管上皮细胞 小鼠卵巢表面上皮细胞
重点核对
电穿孔参数（30 V、3脉冲、1秒间隔、50 ms脉冲长度） 质粒浓度（100-400 ng/μL） 小鼠品系（C57BL/6背景） 基因突变组合（Brca1、Tp53、Pten，有或无Lkb1） 肿瘤发生潜伏期和渗透率（Lkb1缺失组6-14个月腹膜转移96%，腹水74%；Lkb1完整组腹膜转移21%）
摘要
卵巢癌是迄今为止最致命的妇科癌症。高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）占卵巢癌病例的大部分，且最常在晚期被诊断。在此，我们开发了一种新策略，通过结合体内电穿孔和CRISPR-Cas9介导的基因组编辑来生成体细胞卵巢癌小鼠模型。与HGSOC相关的肿瘤抑制基因以两种不同组合（Brca1、Tp53、Pten，有或无Lkb1）突变，成功生成了HGSOC，尽管潜伏期和病理生理学有所不同。在该系统中实施Cre谱系追踪，能够在免疫活性环境中可视化腹膜微小转移。此外，这些模型显示出拷贝数改变和与人类HGSOC相似的表型。由于该策略在选择突变组合和靶向区域方面具有灵活性，它可能对生成小鼠模型以推进对卵巢癌的理解和治疗非常有用。意义：这项研究揭示了一种新策略，用于生成卵巢癌遗传小鼠模型，在选择突变组合和靶向区域方面具有高度灵活性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何利用体内电穿孔和CRISPR-Cas9技术灵活生成可模拟人类HGSOC的小鼠模型，并研究不同肿瘤抑制基因组合和细胞起源对肿瘤发生的影响？
- 核心机制
- PTEN和Lkb1缺失导致AKT/mTOR通路激活；Lkb1缺失影响细胞极性、完整性和能量代谢，促进肿瘤起始和进展；不同细胞类型（输卵管上皮和卵巢表面上皮）对特定突变组合具有不同的易感性。
- 主要证据
- 通过体内输卵管电穿孔递送CRISPR-Cas9和Cre质粒，靶向Brca1、Tp53、Pten和Lkb1，成功诱导HGSOC；组织病理学和免疫组化证实肿瘤表达PAX8、WT1、CK8；全基因组测序显示拷贝数改变与人类HGSOC相似；单细胞RNA测序显示腹水细胞组成与人类相似。
- 研究意义
- 该策略为生成HGSOC及其他卵巢癌遗传小鼠模型提供了灵活工具，有助于研究细胞起源、肿瘤异质性、腹膜转移机制，并可用于评估治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
诱导肿瘤抑制基因突变
在输卵管上皮细胞中引入Brca1、Tp53、Pten及Lkb1的突变，模拟HGSOC相关遗传改变。
电穿孔递送针对Brca1、Tp53、Pten的sgRNA质粒和Cre质粒，在Lkb1完整和缺失小鼠中诱导基因敲除或突变。
肿瘤发生监测和组织病理学分析
观察不同基因突变组合下肿瘤的发生时间、位置和生长模式。
对电穿孔后小鼠进行不同时间点的解剖，记录卵巢肿瘤、腹膜转移和腹水形成，并通过H&E和免疫组化染色分析肿瘤组织。
腹膜微转移可视化
利用Cre谱系追踪检测传统方法无法发现的腹膜微小转移灶。
通过RFP表达在免疫活性环境中观察腹膜微转移的形成和形态特征。
基因突变分析（MiSeq）
验证电穿孔后靶基因的突变类型和频率。
对RFP+输卵管上皮细胞和肿瘤样本进行MiSeq扩增子测序，分析Brca1、Tp53、Pten的插入缺失突变。
全基因组测序和拷贝数分析
评估肿瘤样本的拷贝数改变，并与人类HGSOC特征比较。
对多个肿瘤样本进行全基因组测序，使用CNVkit分析拷贝数变异，并生成热图。
单细胞RNA测序分析腹水细胞组成
分析腹水中肿瘤细胞和免疫细胞的组成，与人类HGSOC腹水环境比较。
从一只Lkb1缺失小鼠的腹水中分离单细胞，进行scRNA-seq，鉴定不同细胞群体。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证分子表达变化
验证基因突变
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 体内输卵管电穿孔 | PX330质粒 | -- | Addgene #42230 |
| PCS2 CreNLS质粒 | -- | -- | |
| BTX 830电穿孔仪 | BTX | -- | |
| 3mm镊式电极 | BTX | Item #45-0487 | |
| 组织病理和免疫荧光 | PAX8抗体 | ProteinTech | 10336-1-AP |
| Ki67抗体 | Invitrogen | 14-5698-82 | |
| WT1抗体 | Abcam | ab89901 | |
| CK8抗体 | Abcam | ab53280 | |
| 乙酰化微管蛋白抗体 | Sigma | T7451 | |
| 磷酸化AKT抗体 | Cell Signaling Technology | #4060 | |
| GATA4抗体 | Invitrogen | #14-9980-82 | |
| LYVE1抗体 | ReliaTech | #103-PA50AG | |
| AF-488鬼笔环肽 | Life Technologies | A12379 | |
| AF-635鬼笔环肽 | Life Technologies | A34054 | |
| 兔二抗488 | Invitrogen | A21206 | |
| 大鼠二抗488 | Invitrogen | A21208 | |
| 小鼠二抗488 | Invitrogen | A21202 | |
| ProLong Gold封片剂 | Invitrogen | P10144 | |
| 共聚焦显微镜 | 蔡司LSM800共聚焦显微镜 | Zeiss | -- |
| 全基因组测序 | GeneRead DNA FFPE试剂盒 | Qiagen | -- |
| 基因组DNA纯化浓缩试剂盒-10 | Zymo | -- | |
| NovaSeq 6000 S4 PE150测序仪 | Illumina | -- | |
| 单细胞RNA测序 | Chromium单细胞3'试剂盒v2 | 10X Genomics | -- |
| Chromium控制器 | 10X Genomics | -- | |
| Dynabeads磁珠 | Thermo Fisher Scientific | 2000048 | |
| SPRIselect磁珠 | Beckman Coulter | B23318 | |
| LabChip微流控芯片 | PerkinElmer | 760517 CLS760672 | |
| Illumina Hiseq4000 PE100测序仪 | Illumina | -- | |
| 细胞分离 | 红细胞裂解液 | Geneaid | -- |
| DMEM/F12培养基 | Gibco | -- | |
| 钙黄绿素-AM | -- | -- | |
| 乙锭同二聚体1 | Thermo Fisher Scientific | L3224 | |
| EVOS FL Auto荧光显微镜 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 胰蛋白酶 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 模型建立 | 电穿孔参数（电压、脉冲次数、间隔、脉冲长度） 阅读提示：Methods: In vivo oviductal electroporation |
| 模型建立 | 质粒浓度和注射体积 阅读提示：Methods: In vivo oviductal electroporation |
| 基因突变 | sgRNA序列和靶向外显子 阅读提示：Methods: Plasmids |
| 肿瘤观察 | 观察时间点（1, 4-5, 6-8, 9-10, 11-14, 15-16个月） 阅读提示：Results: 表1和图2 |
| 肿瘤观察 | 肿瘤发生率、腹膜转移率和腹水发生率 阅读提示：Results: 表1 |
| 组学分析 | 测序深度和样本数量 阅读提示：Methods: Whole-genome sequencing |