样本收集与微生物组、基因组、转录组多组学分析
表征多灶性HCC中微生物群落异质性及其与宿主基因组和转录组改变的关系。
收集58例患者的242个肿瘤结节和58个非肿瘤组织，进行16S rRNA基因测序、全外显子测序和RNA测序。
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多灶性肝细胞癌的肝内微生物异质性及其与宿主基因组和转录组改变的关系
Intrahepatic Microbial Heterogeneity in Multifocal Hepatocellular Carcinoma and Its Association with Host Genomic and Transcriptomic Alterations
实验完整度
高包含体内外功能验证（细胞迁移、侵袭、原位瘤模型）及细菌定植与机制研究（免疫微环境、EMT）。
主要模型
Hep3B 和 Huh7 人肝癌细胞系 RIL-175 小鼠肝癌细胞系 SPF C57BL/6 小鼠原位肝癌模型 无菌 C57BL/6 小鼠模型
重点核对
肿瘤结节类型（IM/MO）的分类标准，依据 WES 突变谱分型 细菌共培养的感染复数（MOI=50）和处理时间（20小时） 原位模型中肿瘤细胞注入数量（5×10^5 或 1×10^5） 抗生素处理方案（1 mg/mL 饮水或 2 mg/mL 瘤内注射） 免疫细胞流式分析的标记和门控策略
摘要
多灶性肝细胞癌（HCC）的肝内微生物组特征及其与基因组改变的关系尚不清楚。本研究对来自58例多灶性HCC患者的242个HCC肿瘤结节和58个相邻非肿瘤组织进行了多组学分析，揭示了多灶性HCC中微生物群落的异质性。通过革兰氏染色、脂多糖、脂磷壁酸染色和透射电子显微镜证实了HCC结节中细菌的存在。突变分析将患者分为肝内转移（IM）-HCC和多中心发生（MO）-HCC。IM和MO结节之间的细菌群落存在差异（P = 0.01）。一个由9种细菌组成的生物标志物组合可以区分IM结节和MO结节，AUROC为0.795。IM结节中上皮-间质转化通路上调，并与IM富集细菌相关。IM富集细菌如粪肠球菌和咽峡炎链球菌通过诱导免疫抑制微环境和上皮-间质转化，在肝癌原位小鼠模型中促进HCC细胞迁移、侵袭和肿瘤进展。总之，肝内微生物组有助于多灶性HCC的异质性和发病机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 在多灶性肝细胞癌中，肝内微生物组在不同肿瘤结节之间是否存在异质性，以及这种异质性是否与宿主基因组和转录组改变相关并影响肿瘤进展？
- 核心机制
- IM富集细菌（如粪肠球菌和咽峡炎链球菌）通过诱导免疫抑制微环境和上皮-间质转化（EMT）促进肿瘤生长和转移。
- 主要证据
- 通过16S rRNA测序发现IM和MO结节微生物组成差异；体外共培养实验和原位小鼠模型显示IM富集细菌促进肿瘤生长并诱导EMT和免疫抑制。
- 研究意义
- 研究揭示了多灶性HCC中细菌异质性，提示细菌异质性可作为生物标志物和治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细菌存在验证
确认HCC肿瘤组织中存在细菌。
进行革兰氏染色、LPS/LTA免疫组化染色和透射电子显微镜观察。
基因组异质性分析
评估多灶性HCC的克隆来源和进化关系。
对235个肿瘤结节和56个非肿瘤组织进行WES，构建系统发育树，计算ITH指数。
微生物群落差异分析与分类模型构建
比较IM和MO结节间微生物组成差异，并建立区分模型。
进行β多样性分析、LEfSe差异分析，构建随机森林分类模型。
转录组与微生物整合分析
鉴定与IM富集细菌相关的宿主基因表达改变。
进行RNA-seq差异表达分析，GSEA通路富集，Spearman相关性分析。
体外功能实验
验证IM富集细菌对HCC细胞迁移和侵袭的影响。
将HCC细胞与粪肠球菌或咽峡炎链球菌共培养，进行划痕实验和Transwell迁移/侵袭实验。
体内功能验证（SPF小鼠原位模型）
验证IM富集细菌在体内促进肿瘤生长和转移的作用。
将RIL-175细胞与细菌共培养后原位注射到C57BL/6小鼠肝脏，比较肿瘤大小，并进行免疫组化和流式分析。
细菌定植与肝转移验证（无菌小鼠模型）
验证IM富集细菌能否从肠道转移到肝脏并促进肿瘤生长。
无菌小鼠口服灌胃细菌8周，建立原位肿瘤模型，通过PCR、培养、FISH检测细菌，观察肿瘤生长。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 16S rRNA测序 | AMPure XP磁珠 | Beckman Coulter Genomics | -- |
| Qubit荧光计 | Invitrogen | -- | |
| Agilent 2100生物分析仪 | Agilent | -- | |
| DNA提取 | DNeasy血液和组织试剂盒 | QIAGEN | -- |
| WES文库构建 | NimbleGen人类外显子组阵列 | NimbleGen | -- |
| Agilent人类外显子组阵列 | Agilent | -- | |
| 细菌培养 | 脑心浸液琼脂 | Thermo Fisher Scientific | CM1136B |
| 脑心浸液肉汤 | Thermo Fisher Scientific | CM1135B | |
| AnaeroGen产气袋 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 厌氧罐（C-31） | Mitsubishi Gas Chemical | -- | |
| TissueLyser II组织研磨器 | QIAGEN | 85300 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| RPMI 1640培养基 | Gibco | C11875500BT | |
| 支原体检测 | MycoBlue支原体检测试剂盒 | Vazyme | D101 |
| 流式细胞术 | 可固定活性染料700 | BD Biosciences | 564997 |
| Fc受体封闭液 | BD Biosciences | 553141 | |
| 抗CD45抗体 | BD Biosciences | 564279 | |
| 抗CD11b抗体 | BioLegend | 101206 | |
| 抗Gr1抗体 | BD Biosciences | 740850 | |
| 抗Ly6C抗体 | BioLegend | 128016 | |
| 抗Ly6G抗体 | BD Biosciences | 560601 | |
| 白细胞活化混合物（含BD GolgiPlug） | BD Biosciences | 550583 | |
| 抗CD3e抗体 | BD Biosciences | 557596 | |
| 抗CD4抗体 | BD Biosciences | 563106 | |
| 抗CD8抗体 | BioLegend | 100734 | |
| BD固定和透化溶液 | BD Biosciences | 554722 | |
| 抗IFNγ抗体 | BD Biosciences | 564336 | |
| 抗颗粒酶B抗体 | Thermo Fisher Scientific | 25-8898-82 | |
| Cytek Aurora流式细胞仪 | Cytek Biosciences | -- | |
| FlowJo 10版本软件 | -- | -- | |
| 免疫组化 | 抗E-钙黏蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 3195S |
| 抗N-钙黏蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 13116S | |
| 抗Snail抗体 | ServiceBio | GB11260 | |
| 抗Ki-67抗体 | Cell Signaling Technology | 12202S | |
| 抗LPS抗体 | Hycult Biotech | HM6011 | |
| 抗LTA抗体 | Hycult Biotech | HM2048 | |
| 染色 | 革兰氏染色试剂盒（改良Brown & Brenn） | Baiao Laibo Technology | BTN160634 |
| 显微镜检查 | Olympus BX63F荧光显微镜 | Olympus | 9072693 |
| JEM-1200电子显微镜 | JEOL | -- | |
| FISH | FITC标记探针 | -- | -- |
| DAPI抗淬灭剂 | Abcam | ab104139 | |
| PCR | Quick-DNA粪便/土壤微生物小提试剂盒 | Zymo Research | D6010 |
| Premix Taq DNA聚合酶 | Takara Bio | R028A | |
| 迁移/侵袭实验 | Falcon Transwell小室 | Falcon | 8.0 |
| Matrigel包被的Transwell小室 | Corning | -- | |
| CODEX | CODEX染色试剂盒 | Akoya Biosciences | -- |
| 细菌菌株 | 咽峡炎链球菌 ATCC 33397 | ATCC | 33397 |
| 具核梭杆菌 ATCC 25586 | ATCC | 25586 | |
| 大肠杆菌MG1655 ATCC 700926 | ATCC | 700926 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样品采集 | 样本来源：患者，来自中山大学附属第一医院；肿瘤结节数量：3-11个/患者；相邻非肿瘤组织距肿瘤>5cm。 阅读提示：Methods: Patients and Sample Collection |
| 16S rRNA测序 | 测序区域：V3-V4；引物序列；PCR条件；测序平台NovaSeq PE250。 阅读提示：Methods: DNA Extraction and 16S Sequencing |
| 细菌存在验证 | 染色方法：革兰染色、LPS/LTA IHC；组织样本数：40。 阅读提示：Figure 1C legend |
| 基因组分析 | WES测序深度：205×；突变检测标准：肿瘤中≥5%读段支持且≥5条reads。 阅读提示：Methods: Reads Mapping and Variation Detection |
| IM/MO分类 | 分类依据：WES突变谱，分为IM（树干突变占比高）、MO（无共享突变）、混合。 阅读提示：Results: Discrimination of IM-HCC and MO-HCC by Phylogenetic Analysis |
| 微生物差异分析 | 统计分析：PERMANOVA；LEfSe阈值LDA>3；分类模型：随机森林，训练/验证6:4。 阅读提示：Methods: Differential Abundance Bacteria and Classification Model |
| 体外共培养 | MOI=50；时间20小时；细胞系Hep3B和Huh7；培养基条件；加庆大霉素（200 µg/mL）杀灭细菌。 阅读提示：Methods: Wound-Healing Assay, Transwell Migration and Invasion Assays |
| SPF原位模型 | 小鼠品系：C57BL/6；性别：雄性；年龄：4-6周；细胞数量：RIL-175 5×10^5；注射部位：肝左叶；抗生素剂量：1 mg/mL饮水。 阅读提示：Methods: SPF and Germ-Free Orthotopic and Subcutaneous Mouse Models, Antibiotic Treatments |
| 无菌小鼠模型 | 小鼠：C57BL/6雄性5-6周（此处原文为6-8周）；灌胃细菌组合：EF+SA、EF+SA+FN；灌胃时间8周；原位注射细胞数：RIL-175或Hepa1-6 1×10^5。 阅读提示：Methods: SPF and Germ-Free Orthotopic and Subcutaneous Mouse Models |
| 流式细胞术 | 标记抗体和稀释比例；固定/破膜方案；细胞因子刺激条件（Leukocyte Activation Cocktail with BD GolgiPlug，4-6小时）。 阅读提示：Methods: Flow Cytometry Analysis of Immune Cells |
| CODEX | 组织样本数：IM-HCC N=6，MO-HCC N=4；抗体组合见补充表S9；分析软件及参数。 阅读提示：Methods: CODEX Staining, Image Processing, and Cell Segmentation |