验证CD70表达
确定CD70在多种肿瘤中的表达水平，评估其作为CAR靶点的可行性。
通过免疫组化检测多种实体瘤和血液恶性肿瘤组织微阵列中CD70表达，以及流式细胞术检测AML患者骨髓和淋巴瘤患者淋巴结样本。
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CD28共刺激通过LCK/CD3ζ/ZAP70信号轴增强CAR NK细胞中的CAR信号
CD28 Costimulation Augments CAR Signaling in NK Cells via the LCK/CD3ζ/ZAP70 Signaling Axis
实验完整度
高研究包含体外细胞实验、多种动物模型、患者样本分析及机制验证，功能验证和机制研究充分。
主要模型
脐带血来源的NK细胞 Raji淋巴瘤小鼠模型 THP1急性髓系白血病小鼠模型 BCX010乳腺癌转移模型 SKOV3卵巢癌小鼠模型
重点核对
NK细胞来源：脐带血或外周血 CAR构建：CD27胞外域与不同共刺激域（CD28、4-1BB、DAP10、DAP12）和CD3ζ连接 效应细胞与靶细胞比例：1:1或2:1 处理时间：短时细胞毒性18小时，长期再挑战10-11天 动物模型：NSG小鼠，细胞注射数量及途径
摘要
嵌合抗原受体（CAR）设计的多个因素影响CAR T细胞活性，共刺激信号是关键组成部分。然而，共刺激域对CAR工程化自然杀伤（NK）细胞下游信号传导及后续功能的影响仍 largely 未被探索。在此，我们使用靶向CD70的CAR评估了不同共刺激域对CAR-NK细胞活性的影响。我们发现，CD28（一种成熟NK细胞中天然不存在的共刺激分子）显著增强了CAR-NK细胞的抗肿瘤功效和长期细胞毒性，无论是在体外还是在多种血液和实体瘤异种移植模型中。机制上，我们表明CD28与CD3ζ连接形成平台，招募关键激酶如LCK和ZAP70，启动增强CAR-NK细胞功能的信号级联。我们的研究提供了关于CD28共刺激如何增强CAR-NK细胞功能的见解，并支持将其纳入基于NK的CAR用于癌症免疫治疗。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 旨在确定哪种共刺激分子对CAR-NK细胞功能最有效，并探讨其机制。
- 核心机制
- CD28共刺激域通过招募LCK，促进CD3ζ磷酸化，进而增强ZAP70结合和下游信号传导（如AKT通路），增强CAR-NK细胞功能。
- 主要证据
- 体内外实验表明，CAR27-28ζ NK细胞在长期细胞毒性、多项细胞因子产生和动物生存期方面优于其他共刺激域。机制研究通过Western blot、免疫沉淀和质谱验证LCK-CD3ζ-ZAP70信号轴。
- 研究意义
- 支持将CD28整合入NK细胞CAR设计，基于此已启动I/II期临床试验。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
构建CAR载体并转导NK细胞
生成表达不同共刺激域（DAP10、DAP12、CD28、4-1BB）的CAR27 NK细胞。
从脐带血分离NK细胞，用含不同CAR构建的逆转录病毒转导，包括CD27胞外域、CD28跨膜域、不同共刺激域和CD3ζ，并包含IL15转基因。
体外功能评估
比较不同CAR27 NK细胞对CD70阳性肿瘤细胞的短期和长期杀伤能力及细胞因子产生。
通过流式细胞术检测CD107a、IFN-γ、TNF-α，使用Incucyte和xCELLigence系统进行细胞毒性实验，并采用3D球体杀伤实验。
体内抗肿瘤活性
在多种血液和实体瘤模型动物中评估不同CAR27 NK细胞的抗肿瘤效果。
使用NSG小鼠，接种Raji、THP1、BCX010和SKOV3肿瘤细胞，随后输注CAR27 NK细胞，监测肿瘤负荷和生存期。
机制研究
阐明CD28共刺激增强CAR-NK细胞功能的分子机制。
通过Western blot分析CD3ζ和ZAP70磷酸化水平，免疫共沉淀检测LCK与CD28结合及ZAP70与CD3ζ结合，LCK敲除实验验证LCK必要性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Invitrogen | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| L-谷氨酰胺 | Invitrogen | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Invitrogen | -- | |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| EMEM培养基 | -- | -- | |
| DMEM/F12培养基 | -- | -- | |
| 表皮生长因子 | Pepro Tech | -- | |
| 碱性成纤维细胞生长因子 | Pepro Tech | -- | |
| B27补充剂 | Invitrogen | -- | |
| MycoAlert支原体检测试剂盒 | Lonza | -- | |
| NK细胞分离和扩增 | Ficoll-Histopaque密度梯度液 | Sigma | -- |
| NK细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | -- | |
| 重组人IL-2 | Chiron | -- | |
| ViaStain AOPI染色液 | Nexcelom | -- | |
| Cellometer Auto 2000细胞计数仪 | Nexcelom | -- | |
| 逆转录病毒生产 | SFG逆转录病毒载体 | -- | -- |
| GeneArt基因合成 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| NK细胞转导 | 人纤连蛋白包被的培养板 | Clontech Laboratories | -- |
| 免疫组化 | CD70抗体 | R&D systems | MAB2738 |
| Bond Polymer Refine检测试剂盒 | Leica Biosystems | DS9800 | |
| Aperio AT2扫描仪 | Leica Biosystems | -- | |
| HALO图像分析软件 | Indica Labs | -- | |
| 流式细胞术 | PE抗人CD70抗体 | Biolegend | 355110 |
| APC抗人CD34抗体 | BD Biosciences | 555824 | |
| APC/Cy7抗人CD45抗体 | BD Biosciences | 557833 | |
| A700抗人CD117抗体 | BioLegend | 313246 | |
| PE/TR抗人CD123抗体 | BioLegend | 396708 | |
| PE/Cy5抗人CD90抗体 | Biolegend | 328112 | |
| UV395抗人CD33抗体 | BD Biosciences | 740293 | |
| FITC抗人谱系抗体混合物 | Biolegend | 348801 | |
| PE/Cy7抗人CD38抗体 | BD Biosciences | 560677 | |
| BV711抗人CD45RA抗体 | BD Biosciences | 563733 | |
| 可固定活性染料 | Thermo Fisher Scientific | L34955 | |
| LIVE/DEAD可固定Aqua死细胞染料 | Thermo Fisher Scientific | L34957 | |
| 人Fc受体封闭液 | Miltenyi Biotec | -- | |
| Perfix Expose试剂盒 | Beckman Coulter | B26976 | |
| NK功能实验 | 布雷菲德菌素A | BD Biosciences | 555029 |
| 莫能菌素 | Biolegend | 420701 | |
| CD107a抗体 | BioLegend | 328644 | |
| 细胞激活混合物 | Biolegend | 423301 | |
| IFN-γ抗体 | BD Biosciences | 557647 | |
| TNF-α抗体 | BD Biosciences | 561311 | |
| BD Cytofix/Cytoperm缓冲液 | BD Biosciences | 554714 | |
| 细胞毒性实验 | Vybrant DyeCycle Ruby染料 | Thermo Fisher Scientific | V10273 |
| Incucyte Nuclight Red标记 | Sartorius | 4625 | |
| Incucyte Cytotox Green染料 | Sartorius | 4633 | |
| CellEvent Caspase-3/7绿色检测试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| xCELLigence RTCA E-板 | Agilent | -- | |
| xCELLigence仪 | Agilent | -- | |
| RTCA免疫治疗模块软件 | Agilent | -- | |
| 单细胞分泌组分析 | IsoCode芯片 | IsoPlexis | -- |
| 人NK细胞因子组合 | IsoPlexis | -- | |
| 纯化抗人CD27抗体 | Thermo Fisher Scientific | MA5-34708 | |
| ELISA | IL-15 ELISA试剂盒 | Invitrogen | -- |
| 磷酸化Akt (S473)和总Akt ELISA试剂盒 | RayBiotech | PEL-AKT-S473-T-1 | |
| 动物实验 | Xenogen IVIS-200成像系统 | PerkinElmer | -- |
| Living Image软件 | Caliper | -- | |
| 蛋白质印迹 | IP裂解缓冲液 | Pierce Biotechnology | -- |
| 蛋白酶抑制剂 | Roche | -- | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Pierce | -- | |
| 聚偏二氟乙烯膜 | Bio-Rad | -- | |
| pCD3Z Tyr142抗体 | Abcam | ab68235 | |
| 总CD3Z抗体 | Bethyl Laboratories | A305-212A | |
| Lck抗体 | CST | 2787 | |
| pZAP70抗体 | CST | 2701 | |
| ZAP70抗体 | CST | 3165 | |
| CD28抗体 | CST | 38774 | |
| pAKT Ser 473抗体 | CST | 4060 | |
| 泛AKT抗体 | CST | 4691 | |
| β-肌动蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| 增强化学发光试剂 | Amersham | -- | |
| 免疫共沉淀 | 蛋白G偶联琼脂糖珠 | Roche Diagnostics | -- |
| 质谱分析 | Bis-Tris NuPAGE凝胶 | Life Technologies | -- |
| CRISPR基因编辑 | P3原代细胞4D-Nucleofector X试剂盒S | Lonza | -- |
| 4D-Nucleofector电转仪 | Lonza | -- | |
| 细胞毒性实验 | Incucyte S3活细胞分析系统 | Sartorius | 4647 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CAR构建 | CAR构建体的组成：CD27胞外域、CD28跨膜域、不同共刺激域（CD28、4-1BB、DAP10、DAP12）、CD3ζ信号域；突变体构建（Y6F、dPYAP） 阅读提示：参见Methods 'Generation of retroviral constructs' |
| NK细胞制备 | NK细胞来源（脐带血或外周血）、分离方法、扩增条件（饲养细胞类型、IL-2浓度）、转导时间 阅读提示：参见Methods 'Cord blood NK cell isolation and expansion' |
| 体外功能实验 | 效应细胞与靶细胞比例（如1:1或2:1）、共培养时间、检测指标（CD107a、IFN-γ、TNF-α等） 阅读提示：参见Methods 'NK functional assay', 'Incucyte live cell cytotoxicity assay' |
| 体内动物实验 | 小鼠品系（NSG）、照射剂量、肿瘤细胞数量和接种途径、NK细胞输注剂量和时间 阅读提示：参见Methods 'Animal experiments' 和对应图例 |
| 机制研究 | CD27抗体刺激浓度和时长、LCK敲除sgRNA序列、免疫沉淀抗体 阅读提示：参见Methods 'Western blotting', 'Immunoprecipitation and LC-MS/MS' |