体外共培养代谢谱分析
探究肿瘤细胞与T细胞相互作用时，CD8+ T细胞一碳代谢的变化是否依赖于TCR信号。
使用OT-1细胞与B16-OVA（表达抗原）或B16（不表达）共培养，结合13C-葡萄糖、13C-丝氨酸和13C-甘氨酸示踪，快速分离细胞后进行LC-MS分析代谢物。
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甲酸补充增强抗肿瘤CD8+ T细胞适应性及PD-1阻断的疗效
Formate Supplementation Enhances Antitumor CD8+ T-cell Fitness and Efficacy of PD-1 Blockade
实验完整度
高研究包含体外共培养代谢追踪、CRISPR基因敲除、体内肿瘤模型及单细胞RNA测序，并通过功能验证和机制验证明确CD8+ T细胞依赖性。
主要模型
OT-1 CD8+ T细胞 B16-OVA黑色素瘤模型 B16肿瘤细胞 小鼠
重点核对
甲酸补充浓度：饮水中5 mg/mL 抗PD-1给药剂量和时间：100 μg/剂，肿瘤接种后第10天和第13天 CD8+ T细胞耗竭抗体：抗CD8β抗体（10 mg/kg/剂） B16-OVA肿瘤细胞接种量：250,000细胞/鼠 CD8+ T细胞与肿瘤细胞共培养比例：1:5
摘要
肿瘤微环境（TME）限制抗肿瘤CD8+ T细胞功能和免疫治疗反应。癌细胞损害TME内CD8+ T细胞的代谢适应性，但机制尚不清楚。在此我们证明，一碳（1C）代谢在T细胞中以抗原特异性方式增强。使用甲酸进行1C代谢的治疗性补充可增强CD8+ T细胞适应性及PD-1阻断在B16-OVA肿瘤中的抗肿瘤疗效。甲酸补充驱动CD8+ T细胞代谢的转录改变，并增加细胞增殖和活化的基因特征。甲酸联合抗PD-1治疗可增加肿瘤浸润性CD8+ T细胞，这对于增强的肿瘤控制至关重要。我们的数据表明，甲酸为经抗PD-1恢复活力的CD8+ T细胞提供代谢支持，以克服TME中1C代谢的代谢脆弱性，从而进一步改善T细胞功能。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 一碳代谢是否限制CD8+ T细胞抗肿瘤功能，补充甲酸能否增强PD-1阻断的疗效？
- 核心机制
- 甲酸补充为CD8+ T细胞提供一碳单位，增强其代谢适应性，包括增殖和效应功能，从而协同抗PD-1治疗改善肿瘤控制。
- 主要证据
- 体外和体内实验显示，甲酸联合抗PD-1增加肿瘤浸润性CD8+ T细胞数量（特别是CX3CR1+亚群），促进其增殖和细胞毒性，CD8+ T细胞耗竭后效应消失；单细胞RNA测序显示代谢通路转录重编程。
- 研究意义
- 作者提出甲酸补充是克服肿瘤微环境中一碳代谢脆弱性、增强免疫检查点阻断疗效的新策略，为代谢支持与免疫治疗联合提供基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
TCR信号强度对一碳代谢的影响
验证CD8+ T细胞丝氨酸生物合成和1C代谢是否受TCR信号强度调控。
用不同浓度SIINFEKL肽脉冲的脾细胞或不同浓度抗CD3激活CD8+ T细胞，通过蛋白质印迹检测PHGDH、SHMT1/2表达，并用13C-葡萄糖示踪检测丝氨酸合成。
丝氨酸缺乏对CD8+ T细胞功能的影响
探讨在缺乏丝氨酸和甘氨酸的环境中，CD8+ T细胞增殖和杀伤功能是否受损，甲酸能否恢复。
在含或不含丝氨酸/甘氨酸的培养基中激活naïve OT-1细胞，添加或不添加甲酸，检测增殖（CTV稀释）、活化标志物CD44及对B16-OVA细胞的体外杀伤。
CRISPR基因敲除验证丝氨酸生物合成的体内作用
证实CD8+ T细胞内在的丝氨酸生物合成在肿瘤微环境中对抗肿瘤免疫十分重要。
利用CHIME系统敲除Phgdh（编码丝氨酸生物合成限速酶），对照和Phgdh敲除OT-1细胞共转移至荷瘤小鼠，分析肿瘤中两种细胞的比率。
体内治疗实验
评估甲酸补充与抗PD-1联合是否改善B16-OVA肿瘤控制和生存期，并验证CD8+ T细胞依赖性。
给B16-OVA荷瘤小鼠提供对照或含甲酸饮水，并在肿瘤可触及后给予抗PD-1或同型对照，监测肿瘤体积和生存期；在CD8β耗竭小鼠中重复。
单细胞转录组分析
无偏地阐明甲酸补充联合抗PD-1对肿瘤浸润CD8+ T细胞转录组和代谢通路的影响。
从治疗后的B16-OVA肿瘤中分选CD8+ T细胞进行scRNA-seq，聚类分析不同细胞亚群，并计算KEGG代谢通路评分。
流式细胞术验证关键细胞群
在蛋白水平验证联合治疗对CD8+ T细胞增殖、效应功能和耗竭状态的影响。
分析肿瘤浸润淋巴细胞中OVA特异性CD8+ T细胞数量、BrdU掺入、Granzyme B表达以及CX3CR1+亚群。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
基因编辑
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Thermo Fisher Scientific | 11995065 |
| RPMI-1640培养基 | Thermo Fisher Scientific | 11875-119 | |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher Scientific | 1743489 | |
| 青霉素-链霉素 | Thermo Fisher Scientific | 5140-122 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630-130 | |
| T细胞活化 | 抗CD3抗体 | BioXCell | BE0001-1 |
| 抗CD28抗体 | BioXCell | BE0015-1 | |
| 重组人IL-2 | R&D Systems | 202-IL-050 | |
| 重组小鼠IL-12 | PeproTech | 210-12-50mg | |
| 代谢补充 | 甲酸钠 | Sigma-Aldrich | 456020 |
| 代谢抑制 | SHMT抑制剂（KGD-112） | -- | -- |
| 代谢示踪 | 13C-葡萄糖 | Cambridge Isotope Laboratories | CLM-1396 |
| 13C-丝氨酸 | -- | -- | |
| 13C-甘氨酸 | -- | -- | |
| 代谢物提取 | 甲醇 | -- | -- |
| 氯仿 | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| 戊二酸 | Sigma-Aldrich | G3407 | |
| LC-MS分析 | iHILIC-(P) Classic 色谱柱 | The Nest Group | -- |
| Q Exactive HF-X 轨道阱质谱仪 | Thermo Scientific | -- | |
| 蛋白定量 | Pierce BCA蛋白分析试剂盒 | Pierce | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | Pierce | 89901 |
| 抗SHMT1抗体 | Novus Biologicals | NBP2-32173 | |
| 抗SHMT2抗体 | Novus Biologicals | NBP1-80754 | |
| 抗PHGDH抗体 | Cell Signaling Technologies | 13428 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technologies | 3700 | |
| HRP标记的抗兔IgG | Cell Signaling Technologies | 7074 | |
| HRP标记的抗小鼠IgG | Cell Signaling Technologies | 7076 | |
| HRP标记的抗大鼠IgG | Cell Signaling Technologies | 7077 | |
| SuperSignal West Pico PLUS化学发光底物 | ThermoFisher | 34580 | |
| Western blot成像 | Amersham Imager 600成像仪 | GE Healthcare | -- |
| Western blot | Restore PLUS Western blot剥离缓冲液 | Thermo Scientific | 46430 |
| 流式细胞术 | BD LSR II流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| BD FACS Symphony流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| BD Aria II分选仪 | BD Biosciences | -- | |
| MoFlo Astrios EQ分选仪 | Beckman Coulter | -- | |
| CellTrace Violet细胞增殖试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | C34557 | |
| Live/Dead可固定近红外死细胞染色试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | L34976 | |
| UltraComp微球 | Thermo Fisher Scientific | 01-2222-42 | |
| 小鼠抗体处理 | InVivoMAb抗小鼠CD8β抗体 | BioXCell | BE0223 |
| InVivoMAb抗小鼠PD-1抗体 | -- | -- | |
| InVivoMAb大鼠IgG2a同型对照 | BioXCell | BP0089 | |
| 麻醉 | 2,2,2-三溴乙醇 | MilliporeSigma | T48402-25g |
| 肿瘤分离 | I型胶原酶 | Worthington Biochemical | LS004194 |
| 单细胞测序 | Chromium控制器 | 10X Genomics | -- |
| Illumina NovaSeq 500测序仪 | Illumina | -- | |
| t细胞分离 | naïve CD8+ T细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-096-543 |
| 磁珠分离 | 抗PE微珠 | Miltenyi Biotec | 103-105-639 |
| 流式抗体 | 抗CD45.2-PE抗体 | Biolegend | 109808 |
| t细胞分离 | 抗CD3抗体 | BioXCell | BE0001-1 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 代谢示踪共培养 | OT-1细胞预活化方案、肿瘤细胞共培养比例、13C标记物浓度、细胞分离方法 阅读提示：见Methods 'In vitro assays of T cell metabolism' 和 'In vitro CD8+ T cell isolation for western blot or metabolite analysis' |
| TCR信号强度实验 | SIINFEKL肽浓度梯度、抗CD3浓度、激活时间 阅读提示：见Results 'TCR signal strength dictates induction of 1C metabolism' 及Figure 2 |
| 丝氨酸缺乏实验 | 丝氨酸/甘氨酸缺乏培养基、甲酸浓度、杀伤实验效靶比和共培养时间 阅读提示：见Results 'Metabolite profiling...' 及Methods 'In vitro tumor cell killing' |
| 体内治疗实验 | 甲酸饮水浓度（5 mg/mL）、抗PD-1剂量（100 μg/剂）和给药时间（第10,13天）、肿瘤细胞接种量（250,000）、肿瘤体积监测方法 阅读提示：见Methods 'In vivo formate, antibody treatment, and tumor isolations' |
| CRISPR竞争实验 | gRNA序列、细胞共转移数量、B16-OVA接种量、分析时间点（第14天） 阅读提示：见Methods 'CRISPR gene targeting' 和 'In vivo adoptive transfer' |
| 单细胞RNA测序 | 治疗时间方案（甲酸第9天，抗PD-1第10天）、肿瘤收集时间（第12天）、每样本小鼠数（3只） 阅读提示：见Methods 'Single Cell RNA sequencing' |