构建自发转移模型及样本采集
模拟临床乳腺癌转移过程，获取不同转移阶段的肺组织样本。
将EO771-tdTomato或4T1-tdTomato细胞注射到小鼠乳腺脂肪垫，形成原发肿瘤后切除，通过CT和荧光检测监测自发肺转移，收集转移前、转移早期及不同空间区域（核心、边缘、远端正常组织）的肺组织。
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乳腺癌肺转移的时空图谱鉴定TREM2巨噬细胞为转移边界的调节因子
Spatial and Temporal Mapping of Breast Cancer Lung Metastases Identify TREM2 Macrophages as Regulators of the Metastatic Boundary
实验完整度
高包含体外细胞实验、小鼠自发转移模型、NICHE-seq空间分析及人类患者样本验证，并进行功能验证（迁移实验、T细胞抑制实验）和机制验证。
主要模型
EO771-tdTomato乳腺肿瘤小鼠自发肺转移模型 4T1-tdTomato乳腺肿瘤小鼠自发肺转移模型 人类肺癌转移组织样本
重点核对
细胞系：EO771（ATCC CRL-3461）和4T1（ATCC CRL-2539） 动物模型：PA-GFP转基因小鼠（C57BL/6）和BALB/c小鼠 细胞注射数量：5×10^5 EO771-tdTomato细胞或2×10^5 4T1-tdTomato细胞 原发肿瘤切除时间：注射后3周 转移检测方法：CT成像和tdTomato荧光检测
摘要
癌症死亡率主要源于转移性复发，强调了开发有效的靶向转移免疫疗法的迫切需求。为了更好地理解塑造转移微环境的细胞和分子事件，我们使用自发性乳腺癌肺转移模型，构建了涵盖不同转移阶段和区域的单细胞图谱。我们发现，转移前肺组织被炎性中性粒细胞和单核细胞浸润，随后随着转移的出现，抑制性巨噬细胞积累。空间分析显示，转移相关免疫细胞存在于转移核心，但TREM2+调节性巨噬细胞独特地富集于转移性浸润边缘，这一现象在小鼠模型和人类患者样本中均一致。这些调节性巨噬细胞（Mreg）有助于形成免疫抑制微环境，将肿瘤细胞隐藏于免疫监视之外。我们的研究提供了跨转移阶段和生态位的免疫细胞动态概览，为开发靶向转移的免疫疗法提供信息。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 乳腺癌肺转移过程中，免疫微环境的时空动态变化如何，特别是哪些免疫亚群在转移生态位中发挥关键作用？
- 核心机制
- TREM2+调节性巨噬细胞（Mreg）富集于转移浸润边缘，通过表达免疫检查点（如Trem2, Gpnmb）和细胞外基质重塑相关基因，形成免疫抑制微环境，抑制T细胞活化，从而促进转移进展。
- 主要证据
- 通过NICHE-seq和单细胞RNA测序分析，结合流式细胞术和免疫荧光，发现Mreg特异性富集于转移边缘，功能实验证明Mreg抑制T细胞活化和IFNγ分泌，并在小鼠模型和人类样本中验证。
- 研究意义
- 本研究揭示了转移生态位中巨噬细胞亚群的空间异质性，强调TREM2+巨噬细胞作为潜在的治疗靶点，为开发针对转移微环境的免疫疗法提供理论基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
单细胞转录组和空间分析
解析转移不同阶段和空间区域的免疫细胞组成和分子特征。
使用NICHE-seq技术对PA-GFP小鼠中的转移核心和浸润边缘进行光标记，随后进行FACS分选和SPID-seq单细胞RNA测序，无监督聚类和注释免疫细胞亚群，并进行差异表达、GO分析和细胞通讯分析。
免疫细胞功能验证
验证关键免疫亚群（如Mreg）的功能，特别是对T细胞活化的影响。
通过流式细胞术分选巨噬细胞，进行体外迁移实验和T细胞共培养抑制实验，评估Mreg对T细胞增殖、活化以及IFNγ分泌的影响。
临床样本验证
验证小鼠模型中发现的Mreg空间分布模式是否在人类肺转移中保守。
对人类肺转移组织切片（包括乳腺癌、黑色素瘤、软组织肉瘤）进行TREM2免疫荧光染色，评估TREM2+细胞在转移核心和边缘的分布。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | EO771 | ATCC | CRL-3461 |
| 4T1 | ATCC | CRL-2539 | |
| 基质胶 | BD Biosciences | 354230 | |
| 组织消化 | IV型胶原酶 | Worthington | -- |
| 脱氧核糖核酸酶I | Roche | -- | |
| 流式分选 | BD FACSAria Fusion流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| 流式分析 | Cytoflex LX流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- |
| LSRII流式细胞仪 | BD | -- | |
| 单细胞测序 | NextSeq 500测序仪 | Illumina | -- |
| NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- | |
| 免疫荧光 | Leica TCS SP8共聚焦显微镜 | Leica | S/N |
| Leica DMi8显微镜 | Leica Microsystems | -- | |
| Aperio Versa 200切片扫描仪 | Leica | -- | |
| 抗TREM2抗体 | Cell Signaling Technology | 91068 | |
| 抗GPNMB抗体 | Abcam | ab234529 | |
| 抗F4/80抗体 | Bio-Rad | MCA497R | |
| 抗TREM2抗体（小鼠） | R&D Systems | AF1729 | |
| 抗tdTomato抗体 | LSBio | LS-C340696 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | MBD0015 | |
| Fluoroshield封片剂 | Sigma-Aldrich | F6182 | |
| T细胞抑制实验 | Pan T细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-095-130 |
| 细胞增殖染料eFluor 450 | Thermo Fisher | 65-0842-85 | |
| 抗小鼠CD3抗体 | BioLegend | 100340 | |
| 抗小鼠CD28抗体 | BioLegend | 102116 | |
| 小鼠IFN-γ ELISA试剂盒 | BioLegend | 430801 | |
| 迁移实验 | 抗CCL6抗体 | R&D Systems | MAB487 |
| Transwell 24孔板 | Corning | CLS3421 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | 小鼠品系：C57BL/6或BALB/c；年龄：8-10周龄雌性；细胞系：EO771-tdTomato或4T1-tdTomato；注射细胞数：5×10^5或2×10^5；原发肿瘤切除时间：3周后 阅读提示：Methods: Animals, Cell Lines, Orthotopic Tumor Transplantations |
| 单细胞测序 | 组织消化酶浓度和条件：DNase I 0.1 mg/mL, Collagenase IV 1 mg/mL, 37°C 15分钟；FACS抗体：CD31-PE/Cy7, CD45-APC/Cy7；测序深度：10K-50K reads/细胞 阅读提示：Methods: Tissue Processing, Single-Cell Sorting, SPID-seq |
| 迁移实验 | 骨髓细胞数量：5×10^5；Transwell孔径：5mm；肺匀浆上清来源：对照、转移前、转移后；抗CCL6抗体浓度：未明确说明 阅读提示：Methods: Migration Assay, Figure 3M-N |
| T细胞抑制实验 | 巨噬细胞分选门控：CD45+ F4/80+或CD45+ CD11b+ Ly6g- 并根据CD9, PDPN, IL7R表达分选；T细胞数量与巨噬细胞比例：1:3；共培养时间：72小时 阅读提示：Methods: Macrophage-T-cell Coculture Activation Assay, Figure 4J, 5L |
| 免疫荧光 | 抗体浓度：未明确说明；孵育时间：一抗4°C过夜；二抗室温1小时；成像显微镜：Leica TCS SP8或Leica DMi8 阅读提示：Methods: Immunostaining, Figure 5M, 6A |