CRISPR/Cas9筛选鉴定肿瘤抑制因子
在TF-1细胞中通过全基因组和定制筛选识别（R）-2HG可能的2OGDD肿瘤抑制靶点。
在TF-1细胞中进行全基因组和定制CRISPR/Cas9敲除筛选，在无细胞因子条件下培养，通过sgRNA富集鉴定赋予细胞因子非依赖性生长的基因。
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（R）-2-羟基戊二酸抑制KDM5组蛋白赖氨酸去甲基化酶以驱动IDH突变型癌症的转化
(R)-2-Hydroxyglutarate Inhibits KDM5 Histone Lysine Demethylases to Drive Transformation in IDH-Mutant Cancers
实验完整度
高包含CRISPR/Cas9筛选、细胞功能实验、体外酶活测定、ChIP-seq和RNA-seq等多层级验证。
主要模型
TF-1人红白血病细胞系 永生化人星形胶质细胞（IHA） 患者来源胶质瘤多细胞肿瘤球（MCTS） 原代AML患者样本
重点核对
TF-1细胞在无细胞因子条件下的增殖能力 （R）-2HG对KDM5酶的IC50值 KDM5A/C/D三重敲除或KDM5c70处理对H3K4me3水平的影响 KDM5c70或突变IDH1表达对IHA细胞软琼脂集落形成的影响
摘要
异柠檬酸脱氢酶（IDH）-1和-2的致癌突变发生在多种癌症中，包括急性髓系白血病（AML）和胶质瘤。突变型IDH酶将2-酮戊二酸（2OG）转化为（R）-2-羟基戊二酸（（R）-2HG），这是一种被认为通过失调2OG依赖性酶促进细胞转化的致癌代谢物。已令人信服地证明能通过突变型IDH促进转化的唯一（R）-2HG靶点是髓系肿瘤抑制因子TET2。然而，有大量证据表明（R）-2HG在IDH突变型癌症中还有其他功能相关的靶点。在这里，我们证明（R）-2HG抑制KDM5组蛋白赖氨酸去甲基化酶，并且这种抑制有助于IDH突变型AML和IDH突变型胶质瘤的细胞转化。这些研究首次提供了组蛋白赖氨酸甲基化失调与IDH突变型癌症转化之间功能联系的证据。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- （R）-2HG除TET2外是否还有其他功能相关的靶点，其抑制是否促进IDH突变型癌症的转化？
- 核心机制
- （R）-2HG抑制KDM5A、KDM5C和KDM5D组蛋白去甲基化酶，导致H3K4三甲基化水平升高，从而促进细胞转化。
- 主要证据
- CRISPR/Cas9筛选鉴定KDM5A/C/D为髓系肿瘤抑制因子；体外酶活实验显示（R）-2HG以低IC50抑制这些酶；TF-1细胞中KDM5A/C/D敲除或KDM5c70处理模拟突变IDH表达；ChIP-seq显示突变IDH或KDM5抑制导致相似的H3K4me3位点增加。
- 研究意义
- 首次提供组蛋白赖氨酸甲基化失调与IDH突变型癌症转化之间功能联系的证据，提示靶向H3K4高甲基化可能成为IDH突变型癌症的治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证KDM5敲除或药物抑制的功能效应
验证KDM5酶缺失或抑制是否足以赋予TF-1细胞因子非依赖性生长。
单独敲除KDM5A、KDM5B、KDM5C或KDM5D，或组合敲除KDM5A/C/D，或用KDM5抑制剂KDM5c70处理，评估TF-1细胞在无细胞因子条件下的增殖。
体外酶活测定（R）-2HG对KDM5的抑制
测定（R）-2HG对重组KDM5酶的抑制浓度（IC50）。
表达并纯化全长重组KDM5A、KDM5B、KDM5C和KDM5D，在体外测定其2OG Km值和（R）-2HG及（S）-2HG的IC50值。
细胞水平验证KDM5抑制对H3K4me3的影响
检验突变IDH表达或KDM5抑制是否导致H3K4me3水平升高。
在等基因TF-1细胞中，通过Western blot检测全球H3K4me3水平，并通过ChIP-seq检测全基因组H3K4me3富集情况，比较IDH1R132H表达、KDM5A/C/D敲除、KDM5c70处理或TFMB-(R)-2HG处理的效果。
转录组分析
检验突变IDH表达和KDM5抑制是否导致相似的转录改变。
对TF-1细胞进行RNA-seq，并进行GSEA分析，评估与H3K4me3富集相关基因的表达变化。
胶质瘤模型验证
检验在胶质瘤细胞中KDM5抑制是否模拟突变IDH的表型。
在IHA细胞和患者来源胶质瘤MCTS中检测H3K4me3水平，并通过软琼脂集落形成实验评估KDM5c70处理或突变IDH表达对转化的影响。
H3K4甲基转移酶抑制逆转转化
检验抑制H3K4甲基转移酶活性是否能逆转突变IDH或TET2缺失诱导的转化。
用MEN1-MLL1抑制剂VTP50469处理TF-1细胞，评估其对细胞因子依赖性增殖和细胞因子非依赖性增殖的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| RPMI培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| 重组人GM-CSF | R&D Systems | 215-GM | |
| 药物处理 | TFMB-(R)-2HG | -- | -- |
| KDM5c70 | Xcessbio | M60192-2S | |
| VTP50469 | Selleck Chemicals | S8934 | |
| 5hmC和5mC定量 | 核酸酶P1 | Sigma-Aldrich | -- |
| 磷酸二酯酶I | Sigma-Aldrich | -- | |
| 小牛肠碱性磷酸酶 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Acquity UPLC寡核苷酸BEH C18色谱柱 | Waters | -- | |
| Agilent 1290液相色谱系统 | Agilent | -- | |
| Agilent 6460三重四极杆串联质谱 | Agilent | -- | |
| 代谢物提取和2HG定量 | 气相色谱-电喷雾电离-质谱联用（GC-MS） | -- | -- |
| 免疫印迹 | 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | -- |
| 4-20% SDS-PAGE凝胶 | BioRad | -- | |
| 0.45 μm PVDF膜 | Millipore | -- | |
| 组蛋白提取试剂盒 | Abcam | -- | |
| 0.2 μm PVDF膜 | Millipore | -- | |
| 辣根过氧化物酶偶联的抗兔抗体 | Jackson ImmunoResearch Labs | 211-032-171 | |
| 辣根过氧化物酶偶联的抗小鼠抗体 | Cell Signaling Technology | 7076 | |
| HA标签抗体 | Cell Signaling Technology | 3724 | |
| 抗KDM5A抗体 | Cell Signaling Technology | 3876 | |
| 抗KDM5B抗体 | Cell Signaling Technology | 3273 | |
| 抗KDM5C抗体 | Abcam | ab34718 | |
| 抗KDM5D抗体 | Millipore | ABE203 | |
| TET2抗体 | Cell Signaling Technology | 18950 | |
| 抗三甲基组蛋白H3赖氨酸4抗体 | Cell Signaling Technology | 9751 | |
| 抗组蛋白H3抗体 | Cell Signaling Technology | 4499 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 4970 | |
| 抗纽蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | V9131 | |
| 细胞增殖检测 | Vi-Cell细胞活力分析仪 | Beckman Coulter | -- |
| 蛋白表达与纯化 | pVL1393载体 | Sigma-Aldrich | E8772 |
| BacMagic-3 DNA试剂盒 | Novagen | -- | |
| pFastBac Dual质粒 | Thermo Fisher Scientific | 10712024 | |
| DH10Bac细胞 | Invitrogen | -- | |
| 抗FLAG M2亲和凝胶 | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| 酶动力学测定 | 牛血清白蛋白（BSA） | Roche | -- |
| 过氧化氢酶 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 2-氧代[1-14C]戊二酸 | Perkin-Elmer | -- | |
| 组蛋白H3(1-21)K4me3肽 | Innovagen | -- | |
| Tri-Carb 2900TR液体闪烁计数器 | Perkin Elmer | -- | |
| ChIP-seq | Sonic Dismembrator Model 100超声破碎仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Magna ChIP A/G试剂盒 | Millipore | -- | |
| H3K4me3抗体 | Millipore | 05-745R | |
| 正常兔IgG | Millipore | 12-370 | |
| 果蝇spike-in染色质 | Active Motif | -- | |
| 果蝇抗H2Av抗体 | Active Motif | 61686 | |
| RNA-seq | RNeasy小提试剂盒 | Qiagen | 74106 |
| Illumina Novaseq 6000测序仪 | Illumina | -- | |
| 软琼脂集落形成 | SeaPlaque琼脂糖 | Lonza | -- |
| 碘硝基四氮唑蓝 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 尼康倒置活细胞成像系统 | Nikon | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | TF-1细胞在含10% FBS、1%青霉素/链霉素和2 ng/mL重组人GM-CSF的RPMI培养基中培养；IHA细胞在含10% FBS的DMEM中培养。 阅读提示：Materials and Methods: Cell lines |
| CRISPR/Cas9筛选 | TF-1细胞表达Cas9，感染Brunello文库或定制文库；感染后传代21天，然后分入含或不含GM-CSF的培养基培养15天；每个sgRNA的细胞数覆盖度（约2000或5000细胞/sgRNA）；MOI=0.3。 阅读提示：Materials and Methods: CRISPR/Cas9 screens |
| 药物处理 | TFMB-(R)-2HG浓度：100 μM、250 μM、500 μM；KDM5c70浓度：50 nM（文中提到）；VTP50469浓度：0-100 nM。 阅读提示：Materials and Methods: Chemical treatments; Figure legends |
| 免疫印迹 | 使用特定抗体（如抗H3K4me3抗体），细胞或组蛋白提取方法。 阅读提示：Materials and Methods: Immunoblot analysis |
| ChIP-seq | 细胞数量：TF-1或IHA细胞2×10^7，AML样本5×10^6，MCTS 1×10^6；甲醛交联条件；超声时程；抗体（H3K4me3和IgG）。 阅读提示：Materials and Methods: ChIP-seq sample preparation |
| 软琼脂集落形成实验 | 种植12,000细胞/孔，软琼脂浓度0.4%顶层和1%底层，培养3-4周，染色。 阅读提示：Materials and Methods: Soft agar colony-forming assays and quantification |