成骨细胞中Htr1b缺失对AML进展的影响
评估成骨细胞HTR1B信号在AML进展中的必要性
利用Htr1b−/−小鼠、条件性敲除（LepR-Cre、COL1A1-Cre、OCN-Cre、Osx-Cre）以及药理学拮抗剂SB224289，移植MLL/AF9 AML细胞，监测生存和白血病负荷。
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犬尿氨酸颠覆成骨细胞中的血清素受体信号驱动急性髓系白血病
Subversion of Serotonin Receptor Signaling in Osteoblasts by Kynurenine Drives Acute Myeloid Leukemia
实验完整度
高包含遗传小鼠模型（条件性敲除）、PDX模型、患者样本分析、体外共培养、代谢组学、RNA-seq、CRISPR/Cas9功能验证及药理学抑制等多个独立证据层级。
主要模型
小鼠MLL/AF9 AML移植模型 患者来源异种移植瘤(PDX)模型 OCI-AML3人类AML细胞系 原代人类成骨细胞
重点核对
成骨细胞中Htr1b的敲除（Htr1bfl/fl; OCN-Cre） AML细胞中IDO1的CRISPR/Cas9敲除 Kyn对HTR1B的结合（IC50约54 μmol/L小鼠，约24 μmol/L人） SAA1处理浓度（1 μg/mL体外，5 μg/mL患者细胞） Epacadostat剂量（0.8或1.6 g/kg饮食，300 mg/kg灌胃）
摘要
肿瘤细胞对微环境的重塑可激活有利于癌症生长的通路。对这种恶性细胞非自主通路的分子描绘和靶向可能有助于克服对靶向治疗的耐药性。在此，我们利用遗传小鼠模型、患者来源的异种移植瘤和患者样本证明，急性髓系白血病（AML）利用外周血清素信号传导重塑骨内膜龛以利于自身。AML的进展需要成骨细胞中存在血清素受体1B（HTR1B），并由AML分泌的犬尿氨酸驱动，犬尿氨酸作为一种癌代谢物和HTR1B配体发挥作用。AML细胞利用犬尿氨酸诱导成骨细胞的促炎状态，通过急性期蛋白血清淀粉样蛋白A（SAA），以正反馈环作用于白血病细胞，增加IDO1（犬尿氨酸合成的限速酶）的表达，从而促进AML进展。这种由犬尿氨酸–HTR1B–SAA–IDO1轴介导的白血病–成骨细胞串扰，可作为一种针对龛的AML治疗方法加以利用，为癌症治疗开辟新途径。
意义：
AML由于耐药克隆的出现，对治疗仍然难以根除。我们展示了一种白血病细胞非自主的进展机制，涉及AML细胞与成骨细胞之间犬尿氨酸–HTR1B–SAA–IDO1轴的激活。通过中断该轴来靶向龛，可以在药理学上加以利用，以阻止AML进展并克服治疗耐药性。
这篇文章在“本期要闻”专题中受到重点介绍，第873页。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- AML细胞如何通过重塑骨髓微环境中的成骨细胞来促进自身进展？
- 核心机制
- AML细胞分泌犬尿氨酸（Kyn），作为HTR1B的配体激活成骨细胞中的HTR1B信号，诱导成骨细胞分泌SAA（SAA1/Saa3），SAA通过AHR通路上调AML细胞中IDO1表达，增加Kyn合成，形成正反馈环路，驱动AML进展。
- 主要证据
- 遗传小鼠模型（Htr1b缺失、Ido1敲除）、PDX模型、患者样本（骨髓血浆Kyn/Trp和SAA1水平）以及体外共培养实验（Kyn竞争结合HTR1B、SAA上调IDO1）等支持该机制。
- 研究意义
- 靶向Kyn–HTR1B–SAA–IDO1轴可能成为针对骨髓龛的AML治疗新策略，且与化疗联合可增强疗效，克服治疗耐药。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
鉴定AML细胞分泌的HTR1B配体
确定除血清素外可能激活成骨细胞HTR1B的AML衍生因子
对OCI-AML3细胞和原代人类成骨细胞单独培养或共培养的上清进行非靶向代谢组学分析，筛选差异代谢物；并通过LC/MS验证。
Kyn对HTR1B的结合与功能验证
验证Kyn是否作为HTR1B的配体并调节其信号
在HEK293T细胞中过表达小鼠或人HTR1B，进行竞争结合实验（[3H]-5-HT）和cAMP功能测定（GloSensor）。
IDO1基因敲除对AML进展的影响
评估IDO1介导的Kyn合成对AML体内生长的必要性
用CRISPR/Cas9靶向小鼠和人AML细胞（MLL/AF9、WEHI-3B、OCI-AML3）的Ido1/IDO1基因，移植到小鼠中监测疾病进展和生存。
鉴定成骨细胞分泌的SAA作为IDO1诱导因子
确定成骨细胞响应AML细胞而分泌的因子及其对IDO1表达的影响
通过RNA-seq分析共培养后成骨细胞和AML细胞的转录变化，筛选候选分泌因子并验证SAA对IDO1上调的作用。
SAA对白血病细胞增殖的作用及机制
验证SAA是否促进白血病细胞增殖并通过AHR通路上调IDO1
用SAA1处理多种AML细胞系、患者来源BM-MNCs和PDX来源细胞，检测增殖和IDO1表达；在PDX体内注射SAA1，分析细胞周期和AML负担；并检测AHR靶基因表达。
药理学抑制IDO1（epacadostat）的疗效评估
评估IDO1抑制剂epacadostat对AML进展的抑制作用及与化疗联合的效果
在MLL/AF9小鼠和PDX模型中给予epacadostat，监测生存、白血病负担和细胞周期；并与Ara-C联合治疗。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | C57BL/6J小鼠 | Jackson Laboratories | JAX:000664 |
| NSG小鼠 | Jackson Laboratories | JAX:005557 | |
| NSGS小鼠 | Jackson Laboratories | JAX:013062 | |
| 药物处理 | 甲状旁腺激素 | Bachem | -- |
| SB224289 | TOCRIS | 1221 | |
| 艾卡哚司他 | AdooQ / InvivoChem | A15554 / V0942 | |
| 血清淀粉样蛋白A1 | PeproTech | 300-53 | |
| 细胞培养 | OCI-AML3 | DSMZ | ACC-582 |
| THP-1 | DSMZ | ACC-16 | |
| MOLM-14 | DSMZ | ACC-777 | |
| HEK293T | ATCC | CRL-3216 | |
| WEHI-3B | ECACC | 86013003 | |
| α-MEM培养基 | Gibco | -- | |
| DMEM培养基 | Corning | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Corning | -- | |
| 分子生物学 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| PureLink RNA迷你试剂盒 | Ambion | -- | |
| PowerUp SYBR Green预混液 | Applied Biosystems | -- | |
| TrueCut Cas9蛋白V2 | Invitrogen | -- | |
| sgRNA | Synthego | -- | |
| GloSensor cAMP质粒 | Promega | -- | |
| pLenti-IDO1-C-mGFP载体 | Origene | RC206592L2 | |
| 代谢组学 | Ostro蛋白沉淀和磷脂去除板 | Waters | 186005518 |
| ABsciex 6500+质谱仪 | AB Sciex | -- | |
| Ace PFP色谱柱 | Advanced Chromatography Technologies | -- | |
| ELISA | 犬尿氨酸ELISA试剂盒 | ImmunoSmol | -- |
| 色氨酸ELISA试剂盒 | ImmunoSmol | -- | |
| 小鼠SAA3 ELISA试剂盒 | Millipore | -- | |
| 淀粉样蛋白A1 DuoSet ELISA试剂盒 | R&D Systems | -- | |
| 放射配体结合 | [3H]-5-羟色胺 | PerkinElmer | -- |
| [3H]-犬尿氨酸 | PerkinElmer | -- | |
| [3H]-GR125743 | PerkinElmer | -- | |
| 流式细胞术 | 抗小鼠CD45抗体 | BioLegend | 103133 |
| 抗人CD45抗体 | BioLegend | 368512 | |
| 抗人CD33抗体 | BioLegend | 303404 | |
| 抗人CD34抗体 | BioLegend | 343518 | |
| 可固定的活力染料 | BioLegend | -- | |
| Click-iT Plus EdU流式细胞术检测试剂盒 | Invitrogen | C10420 | |
| 细胞分选 | 小鼠CD45磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-052-301 |
| 谱系细胞去除试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-092-211 | |
| 细胞培养 | StemMACS HSC扩增培养基XF | Miltenyi Biotec | 130-100-463 |
| StemMACS HSC扩增添加剂 | Miltenyi Biotec | 130-100-843 | |
| Stemspan II培养基 | STEMCELL Technologies | -- | |
| 胶原酶P | Worthington | -- | |
| 免疫荧光 | 抗p65抗体 | Cell Signaling Technology | 8242 |
| DAPI | -- | -- | |
| 防淬灭封片剂Prolong Gold | Invitrogen | -- | |
| 显微镜 | Zeiss LSM 710共聚焦显微镜 | Zeiss | -- |
| 细胞培养 | Lenti-X包装单次用量 | Takara Bio | 631275 |
| 病毒包装 | PEG病毒沉淀试剂盒 | BioVision | K904 |
| Lenti-X GoStix Plus | Takara Bio | 631280 | |
| 转染 | Lipofectamine LTX转染试剂 | Invitrogen | -- |
| Lonza 4D-Nucleofector电转仪 | Lonza | -- | |
| 细胞增殖 | 细胞计数试剂盒8（WST-8） | Abcam | -- |
| 细胞因子处理 | 重组人SAA1 | PeproTech | 300-53 |
| 重组小鼠SAA3 | Cusabio | -- | |
| 重组人IL1α | PeproTech | -- | |
| 重组人IL1β | PeproTech | -- | |
| 重组人IL6 | PeproTech | -- | |
| 重组人CXCL1 | PeproTech | -- | |
| 重组人CXCL5 | PeproTech | -- | |
| 重组人CXCL8 | PeproTech | -- | |
| 重组人CCL2 | PeproTech | -- | |
| 重组人CCL20 | PeproTech | -- | |
| 重组人IL33 | PeproTech | -- | |
| 重组人IL34 | PeproTech | -- | |
| 重组人CXCL3 | PeproTech | -- | |
| 动物实验 | EdU | Cayman Chemical Company | 20518 |
| 阿糖胞苷 | -- | -- | |
| 组织处理 | 蔗糖 | -- | -- |
| 细胞培养 | β-甘油磷酸 | Sigma | -- |
| 抗坏血酸 | Sigma | -- | |
| 聚凝胺 | Millipore | -- | |
| 多西环素 | -- | -- | |
| 支原体检测试剂盒 | Sigma-Aldrich | MP0025 | |
| 白细胞介素3 | PeproTech | -- | |
| 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 | PeproTech | -- | |
| 干细胞因子 | PeproTech | -- | |
| 促血小板生成素 | PeproTech | -- | |
| FMS样酪氨酸激酶3配体 | BioLegend | -- | |
| SR1 | Cayman Chemical | -- | |
| 分析软件 | GraphPad Prism | GraphPad Software | -- |
| ImageJ | -- | -- | |
| FlowJo | -- | -- | |
| Living Image | PerkinElmer | -- | |
| Biorender | -- | -- | |
| STAR | -- | -- | |
| featureCounts | -- | -- | |
| DESeq2 | -- | -- | |
| GSEApy | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠模型 | 背景品系（C57BL/6J），年龄（8-10周），性别（雄雌兼用），注射的AML细胞数量和类型（MLL/AF9 0.2×10^6，WEHI-3B 0.5×10^6） 阅读提示：Methods - Mice, Leukemic Syngeneic Mouse Models |
| 细胞培养 | 细胞系来源（DSMZ, ATCC），培养条件（培养基、FBS浓度、生长因子），原代成骨细胞分离方法 阅读提示：Methods - Cell Lines and Primary Cell Cultures |
| 共培养体系 | transwell孔径（0.4 μm），细胞比例（成骨细胞:白血病细胞=1:10），培养时间（24小时） 阅读提示：Methods - Cocultures |
| 药物处理 | PTH剂量（80 μg/kg/天，i.p.），SB9剂量（5 mg/kg/天，i.p.），Epacadostat剂量（0.8或1.6 g/kg饮食，或300 mg/kg灌胃），SAA1剂量（100 μg/kg，i.v.） 阅读提示：Methods - PTH Bone-Anabolic Treatment, SB224289 treatment, Epacadostat treatment, SAA1 treatment |
| 基因编辑 | sgRNA序列和靶向外显子，Cas9蛋白和sgRNA用量，电转程序（Lonza 4D-Nucleofector），编辑效率验证 阅读提示：Methods - CRISPR/Cas9-Mediated Ido1/IDO1 Genomic Targeting |
| HTR1B结合实验 | 膜制备，放射性配体浓度（[3H]-5-HT 25 nmol/L，[3H]-Kyn 50 μmol/L），竞争化合物浓度范围，缓冲液组成 阅读提示：Methods - Radioligand Binding Assays |
| cAMP信号实验 | 转染质粒（HTR1B和GloSensor），细胞密度，激动剂浓度，测定时间 阅读提示：Methods - cAMP Signaling Assays |
| 代谢组学 | 样本处理（Ostro板），色谱柱（Ace PFP），质谱仪（ABSciex 6500+），代谢物覆盖范围 阅读提示：Methods - Metabolomics |
| 患者样本分析 | 样本类型（BM血浆、BM-MNCs），健康对照的年龄匹配，Kyn/Trp和SAA1测量方法 阅读提示：Methods - Patient Samples, Kyn, Trp, SAA3, and SAA1 Serum/Plasma Levels |