建立MF PDX模型
验证从MF患者外周血分离的CD34+细胞能否在NSGS小鼠中稳定植入并再现疾病特征。
从MF患者PBMC中分离CD34+细胞，培养16小时后经X射线引导胫骨内注射移植入亚致死辐照的NSGS小鼠，12周后评估植入、细胞类型和疾病病理。
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人源化动物模型预测骨髓增殖性肿瘤的克隆演化与治疗脆弱性
A Humanized Animal Model Predicts Clonal Evolution and Therapeutic Vulnerabilities in Myeloproliferative Neoplasms
实验完整度
高包含PDX模型建立、单细胞RNA-seq、外显子测序、ddPCR验证、CRISPR/Cas9基因编辑及药物处理等多项体内外实验。
主要模型
骨髓纤维化患者来源的异种移植模型（PDX） NSGS小鼠 脐带血CD34+细胞（正常对照） MF患者外周血CD34+细胞
重点核对
NSGS小鼠品系及200 rad亚致死辐照剂量 CD34+细胞经X射线引导胫骨内注射途径 移植后12周评估骨髓和脾脏植入水平 鲁索替尼给药方式（饲料掺入，2g/kg） INCB053914给药剂量（30 mg/kg，每日两次）
摘要
骨髓增殖性肿瘤（MPNs）是慢性血液疾病，具有显著的发病率和死亡率。虽然测序研究已阐明驱动这些疾病的基因突变，但MPNs在很大程度上仍无法治愈，且相当比例的患者会进展为快速致命的继发性急性髓系白血病（sAML）。治疗发现受到基因工程小鼠模型无法产生关键人类病理（如骨髓纤维化）的阻碍。为克服这些局限，我们在此提出一种骨髓纤维化（MF）患者来源异种移植瘤（PDX）的人源化动物模型。这些PDX稳健地植入患者细胞，重现了患者的遗传层级和病理，如网状纤维化及MPN起始干细胞的扩增。该模型可选择性地植入罕见的白血病亚克隆，以识别有sAML转化风险的MF患者，并可作为遗传靶点验证和治疗发现的平台。我们提出了一种新颖但可推广的模型来研究人类MPN生物学。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否建立一种能重现人类骨髓纤维化病理和遗传特征的可推广的PDX模型，并用于预测疾病进展和治疗靶点验证？
- 核心机制
- PDX模型通过异种移植的选择压力富集了罕见的白血病前期亚克隆，这些亚克隆携带驱动sAML转化的关键突变（如EZH2Y663H、TP53R248Q），从而预测克隆演化。
- 主要证据
- PDX细胞重现了MF患者的克隆结构和骨髓纤维化；两个病例中，仅在PDX中检出的EZH2Y663H和TP53R248Q突变在患者后期sAML诊断时出现；PIM激酶抑制联合鲁索替尼可显著减少JAK2V617F突变HSC。
- 研究意义
- 该PDX系统可作为研究人类MPN生物学和药物筛选的平台，为MF患者提供预测sAML转化和测试个体化治疗策略的可能性。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证PDX模型中的分子和细胞特性
确认PDX细胞是否保留患者样本的分子特征和HSC群体。
通过流式细胞术分析人HSC（Lineagelow CD34+ CD38- CD45RA- CD90+），单细胞RNA-seq分析患者PBMC与PDX细胞的转录组，对比其聚类和细胞类型组成。
评估PDX模型中的克隆结构
验证PDX是否维持MF患者的突变谱和克隆层级。
对移植前CD34+细胞和移植后hCD45+细胞进行全外显子测序，比较突变VAF，分析不同谱系中的突变分布。
预测sAML转化
评估PDX模型能否识别患者中频率极低、常规测序难以检出的sAML相关亚克隆。
通过外显子测序和ddPCR检测PDX细胞中出现的EZH2Y663H和TP53R248Q突变，并与患者临床病理和后续sAML诊断对照。
遗传验证PIM1靶点
验证PIM1是否为MF细胞功能所必需。
通过CRISPR/Cas9 RNP在MF和脐带血CD34+细胞中敲除PIM1，移植后评估植入和脾肿大情况。
药理验证PIM抑制剂联合鲁索替尼
评估PIM抑制剂INCB053914单药或与鲁索替尼联合对MF PDX的治疗效果。
移植后4周开始治疗，持续4周，评估外周血和骨髓植入、脾重、人HSC负担及纤维化程度。
评估BET抑制剂联合鲁索替尼对纤维化的影响
验证JQ1联合鲁索替尼是否减轻骨髓纤维化。
移植后8周开始用JQ1、鲁索替尼或联合治疗，4周后检测纤维化程度、骨髓植入和HSC负担。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 移植 | NSGS小鼠 | The Jackson Laboratory | 013062 |
| 细胞培养 | SFEMII培养基 | StemCell Technologies | 09605 |
| 细胞分选 | CD34磁珠分选试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-100-453 |
| 细胞因子 | 人干细胞因子 | -- | -- |
| 人促血小板生成素 | -- | -- | |
| 人FLT3配体 | -- | -- | |
| 流式细胞术 | 抗小鼠CD45-BV605抗体 | BioLegend | 103139 |
| 抗人CD45-APC抗体 | BioLegend | 368512 | |
| 抗人CD71-APCcy7抗体 | BioLegend | 334110 | |
| 抗人CD235a-PE抗体 | BioLegend | 349105 | |
| 抗人CD3-FITC抗体 | BioLegend | 317306 | |
| 抗人CD19-PECy7抗体 | BioLegend | 302215 | |
| 抗人CD33-BV421抗体 | BD | 565949 | |
| 抗人CD34-PE抗体 | BioLegend | 343606 | |
| 抗人CD90-PECy7抗体 | BioLegend | 328124 | |
| 抗人CD45RA-BV421抗体 | BioLegend | 304130 | |
| 抗人CD38-FITC抗体 | Invitrogen | 11-0388-42 | |
| 抗人谱系标志物混合物-APC | BioLegend | 348803 | |
| Western blot | 抗pSTAT3抗体 | Cell Signaling Technology | 9145S |
| 抗pSTAT5抗体 | Cell Signaling Technology | 4322S | |
| 抗EZH2抗体 | Cell Signaling Technology | 3147S | |
| 抗H3K27me3抗体 | Cell Signaling Technology | C36B11 | |
| 抗总H3抗体 | Cell Signaling Technology | D1H2 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Santa Cruz | SC-47778 | |
| 组织病理学 | 10%中性缓冲福尔马林 | Fisher Scientific | SF100-4 |
| 单细胞RNA-seq | 10x Genomics Chromium单细胞3'试剂盒v3 | 10x Genomics | PN-1000075 |
| Chromium Chip B单细胞芯片 | 10x Genomics | PN-10000153 | |
| Chromium双索引试剂盒TT Set A | 10x Genomics | PN-1000215 | |
| 全外显子测序 | PureLink基因组DNA提取试剂盒 | Invitrogen | K1820-02 |
| ddPCR | 2x探针supermix（不含dUTP） | Bio-Rad | 1863023 |
| QX-100微滴生成器 | Bio-Rad | -- | |
| QX-100微滴读取器 | Bio-Rad | -- | |
| QuantaSoft v1.7.4软件 | Bio-Rad | -- | |
| 野生型DNA对照 | Promega | G152A | |
| CRISPR/Cas9 | Cas9/核糖核蛋白 | IDT | 1074181 |
| 药物处理 | 鲁索替尼 | Incyte | INCB018424 |
| INCB053914 | -- | -- | |
| JQ1 | MedChemExpress | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 移植 | NSGS小鼠品系、辐照剂量（200 rad）、细胞注射途径（胫骨内）、细胞数量 阅读提示：Methods: Mice and transplantation |
| 细胞培养与分选 | CD34+细胞分离试剂盒、培养基、细胞因子浓度（SCF, TPO, FLT3L各100 ng/mL） 阅读提示：Methods: Human Samples |
| 流式分析 | 抗体克隆、稀释度、染色缓冲液配方 阅读提示：Methods: Flow Cytometry |
| 治疗实验 | 药物剂量、给药方式、治疗起始和持续时间 阅读提示：Methods: Drug Treatments; 图5和图6图注 |
| 纤维化评估 | 固定、脱钙、染色方法、分级标准 阅读提示：Methods: Histopathology; 图1F–G |