VGLL3表达检测
比较RA和OA滑膜组织及FLS中VGLL3表达差异
通过免疫组化、RT-PCR、qPCR检测VGLL3在RA和OA滑膜组织及FLS中的表达。
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VGLL3通过靶向Hippo通路调控类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞中的I型干扰素特征
Regulation of type I interferon signature by VGLL3 in the fibroblast-like synoviocytes of rheumatoid arthritis patients via targeting the Hippo pathway
实验完整度
高包含患者滑膜组织及FLS的体外实验，结合过表达/敲低、RNA-seq、Western blot、免疫荧光、免疫组化、相关性分析及通路干预，进行了功能与机制验证。
主要模型
RA患者滑膜组织 RA-FLS细胞 OA-FLS细胞（对照）
重点核对
VGLL3过表达用lenti-virus MOI 300，5μg/ml polybrene siRNA靶序列（VGLL3 siRNA: GGTCAGTAGTGGATGAACA） JAK抑制剂tofacitinib浓度250 nM RA-FLS培养DMEM+10% FBS，代次P3-P8 IHC染色一抗稀释度及品牌
摘要
背景：I型干扰素（IFN）诱导的干扰素刺激基因（ISG）上调（即I型干扰素特征）在类风湿关节炎（RA）患者中与早期诊断和治疗反应预测相关。然而，调节RA中I型干扰素特征的因素在很大程度上是未知的。在本研究中，我们旨在探讨VGLL3（果蝇vestigial样基因的同源物，Hippo通路的推定调节因子）在RA患者成纤维样滑膜细胞（FLS）中调节I型干扰素特征的作用。方法：从RA和骨关节炎（OA）患者中分离FLS。通过免疫组织化学和PCR分析滑膜组织和FLS中VGLL3的表达。在VGLL3过表达的RA-FLS中进行RNA测序。通过PCR和蛋白质印迹检查干扰素刺激基因的表达。结果：与OA相比，VGLL3在RA滑膜和RA-FLS中上调。VGLL3过表达促进RA-FLS中干扰素刺激基因的表达。STAT1和MX1在RA滑膜中的表达也较OA上调，且与RA和OA患者中VGLL3的表达相关。VGLL3促进RA-FLS中IRF3激活和IFN-β1表达。增加的IFN-β1以自分泌方式诱导RA-FLS中干扰素刺激基因的表达。VGLL3还调节Hippo通路分子WWTR1和AMOTL2的表达，这些分子介导了VGLL3对RA-FLS中IRF3激活和IFN-β1产生的调节。结论：VGLL3通过抑制WWTR1表达驱动RA-FLS中IRF3诱导的IFN-β1表达，并通过自分泌IFN-β1信号随后促进RA-FLS中I型干扰素特征的表达。关键词：类风湿关节炎，干扰素β，I型干扰素特征，Hippo通路
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- VGLL3是否以及如何调节RA-FLS中的I型干扰素特征
- 核心机制
- VGLL3通过抑制Hippo通路核心蛋白WWTR1的表达，解除其对IRF3激活的抑制，促进IRF3磷酸化和核转位，驱动IFN-β1产生，并通过自分泌IFN-β1信号上调干扰素刺激基因。
- 主要证据
- 基于RA-FLS中VGLL3过表达/敲低实验、RNA-seq、Western blotting、免疫荧光等，以及RA/OA滑膜组织的IHC和相关分析。
- 研究意义
- 为RA-FLS中I型干扰素特征的调控提供新见解，并使VGLL3成为RA潜在的治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
VGLL3功能验证
确定VGLL3对干扰素刺激基因表达的影响
通过慢病毒过表达或siRNA敲低VGLL3，运用RNA-seq、qPCR、Western blot检测ISGs表达。
STAT1和MX1相关性分析
在RA和OA滑膜组织中验证STAT1和MX1表达与VGLL3的相关性
通过免疫组化检测STAT1和MX1，并对VGLL3阳性细胞百分比进行相关分析。
机制研究
阐明VGLL3调控ISGs的分子机制，特别是IRF3和Hippo通路的参与
检测IFN-β1表达，IRF3磷酸化和核转位，使用JAK抑制剂tofacitinib阻断IFNAR信号，检测Hippo通路蛋白，并通过siRNA敲低WWTR1进行功能回复实验。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | Hyclone | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| II型胶原酶 | Merck Millipore | -- | |
| 免疫组化 | 兔抗VGLL3抗体 | Merck Millipore | HPA054983 |
| 兔抗MX1抗体 | Proteintech | 13750-1-AP | |
| 兔抗STAT1抗体 | Abcam | ab109320 | |
| 兔IgG同型对照 | Merck Millipore | 12-370 | |
| HRP标记的驴抗兔抗体 | Jackson ImmunoResearch Labs | -- | |
| 免疫荧光 | 兔抗VGLL3抗体 | Abcam | ab83555 |
| 兔抗STAT1抗体 | Abcam | ab109320 | |
| 兔抗磷酸化STAT1抗体 | Cell Signaling Technology | 7649 | |
| 兔抗IRF3抗体 | Abcam | ab76493 | |
| Alexa Fluor 555标记的驴抗兔抗体 | Abcam | ab150130 | |
| 含DAPI的抗淬灭封片剂 | Beyotime Biotechnology | -- | |
| 转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| pHBLV-CMV-MCS-3FLAG-EF1-ZsGreen-T2A-PURO慢病毒载体 | -- | -- | |
| 聚凝胺 | -- | -- | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 反转录PCR | ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover试剂盒 | Toyobo | -- |
| PCR | 2×Hieff™ PCR预混液 | Yeasen | -- |
| qPCR | SYBR Green实时PCR预混液试剂盒 | Toyobo | -- |
| RNA-seq | RNA Nano 6000分析试剂盒 | Agilent Technologies | -- |
| NEBNext® Ultra™ RNA文库制备试剂盒（Illumina®） | NEB | #E7530L | |
| HiSeq PE簇生成试剂盒v4-cBot-HS | Illumina | -- | |
| 蛋白质印迹 | RIPA裂解液 | Beyotime Biotechnology | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime Biotechnology | -- | |
| PVDF膜 | Merck Millipore | -- | |
| 兔抗IRF3抗体 | Abcam | ab68481 | |
| 兔抗YAP/WWTR1抗体 | Cell Signaling Technology | 8418 | |
| 兔抗AMOTL2抗体 | Proteintech | 23351-1-AP | |
| 小鼠抗GAPDH抗体 | Affinity | T0004 | |
| 小鼠抗β-微管蛋白抗体 | Affinity | T0023 | |
| HRP标记的山羊抗兔抗体 | Affinity | S0001 | |
| HRP标记的山羊抗小鼠抗体 | Affinity | S0002 | |
| ECL底物 | New Cell & molecular Biotech | -- | |
| 药物处理 | 托法替尼（JAK抑制剂） | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| FLS分离与培养 | RA患者和OA患者样本数、性别、年龄，FLS代次，胶原酶浓度，培养基及血清 阅读提示：Methods: Collection of synovial tissues and culture of human FLS |
| VGLL3过表达/敲低 | MOI值，polybrene浓度，siRNA序列，转染试剂 阅读提示：Methods: siRNA transfection and lentivirus transduction |
| 干扰素刺激基因表达检测 | 引物序列，RNA提取方法，qPCR条件 阅读提示：Methods: RNA extraction, reverse transcription PCR (RT-PCR), and real-time quantitative PCR (qPCR) |
| 免疫组织化学/荧光 | 抗体稀释度，抗原修复，封闭条件，二抗 阅读提示：Methods: Immunohistochemistry and immunofluorescence staining |
| 机制验证 | JAK抑制剂tofacitinib浓度，处理时间，WWTR1 siRNA序列 阅读提示：Results: VGLL3 facilitating the IRF3-mediated IFN-β production and autocrine signaling in RA-FLS; VGLL3 exacerbated IFN-β1 production by inhibiting Hippo pathway |