人类肌肉组织采集与临床特征分析
收集PAD和非缺血性患者的腓肠肌样本，并评估两组患者的临床基线特征。
收集接受旁路手术的PAD患者和接受动脉瘤手术的非缺血性患者的腓肠肌样本，记录年龄、ABI、Fontaine分级、GLASS分期等临床参数。
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外周动脉疾病中肌肉微环境的单细胞图谱揭示内皮细胞多样性改变和LYVE1+巨噬细胞活化
Single-cell compendium of muscle microenvironment in peripheral artery disease reveals altered endothelial diversity and LYVE1+ macrophage activation
实验完整度
高包含人类样本scRNA-seq、空间转录组、体外细胞实验及内皮特异性ATF4敲除小鼠后肢缺血模型等多个独立证据层级，并进行功能验证与机制验证。
主要模型
人类腓肠肌组织样本（非缺血性患者和PAD患者） 原代人骨骼肌内皮细胞（EC） CD14+外周血单核细胞 内皮特异性诱导型Atf4基因敲除小鼠（Atf4ECKO）后肢缺血模型
重点核对
PAD患者与非缺血性患者的临床特征匹配（年龄、BMI、合并症）及ABI和GLASS分级差异 scRNA-seq分析中每组的患者数（n=4）及10x Genomics平台细胞捕获数目 celastrol处理浓度（125 nM和250 nM）及处理时间（24小时） 条件培养基实验中EC来源的患者数（非缺血性n=3，PAD n=5）及CD14+细胞供体数（n=6） 内皮特异性Atf4敲除小鼠的诱导方案（他莫昔芬剂量和给药方式）
摘要
外周动脉疾病（PAD）由动脉粥样硬化和下肢动脉慢性狭窄引起，导致肌肉灌注减少。目前的治疗方法效果欠佳，部分原因在于对PAD肌肉病理学的了解有限。在此，我们使用单细胞RNA测序和空间转录组学分析了非缺血患者和PAD患者肌肉微环境的组成。我们鉴定了在PAD期间表现出血管生成和免疫调节特征改变的ATF3/ATF4+内皮细胞（EC），并证实EC中的ATF4信号传导对于有效的缺血恢复是必需的。此外，毛细血管EC显示出内皮-间质转化的特征。此外，LYVE1hiMHCIIlow巨噬细胞是人类肌肉中的主要巨噬细胞群，在PAD期间呈现更促炎的轮廓。最后，我们分析了PAD期间肌肉微环境内细胞间通讯的改变，并证实EC衍生因子可影响巨噬细胞极化。该数据集深入表征了PAD肌肉微环境，并为探索靶向治疗提供了资源。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 外周动脉疾病（PAD）患者骨骼肌微环境中的细胞组成、转录变化和细胞间通讯如何改变，特别是内皮细胞和巨噬细胞的表型与功能。
- 核心机制
- PAD中ATF3/ATF4+内皮细胞数量减少、促血管生成和免疫调节功能受损，并发生部分内皮-间质转化；LYVE1hiMHCIIlow巨噬细胞获得促炎表型，且ATF3/ATF4+内皮细胞与LYVE1hi巨噬细胞间通讯改变（如CSF1和GAS6信号下调、IL6上调），可能驱动巨噬细胞活化。
- 主要证据
- 基于人类腓肠肌scRNA-seq和空间转录组学，发现ATF3/ATF4+内皮细胞亚群及LYVE1hi巨噬细胞的变化；通过EC特异性ATF4敲除小鼠后肢缺血模型证实ATF4在缺血恢复中的必要性；体外实验显示PAD EC条件培养基可诱导CD14+细胞向促炎表型极化。
- 研究意义
- 该数据集深入表征了PAD肌肉微环境，为探索靶向治疗提供了资源，并提示纠正内皮-巨噬细胞互作可能作为治疗干预的潜在方向。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
组织学与免疫荧光分析
比较PAD与非缺血性肌肉的肌纤维大小、毛细血管密度和巨噬细胞数量。
对肌肉切片进行H&E染色、CD31免疫荧光染色（与WGA共染）以及CD68和LYVE1共染，量化纤维大小、毛细血管密度和巨噬细胞比例。
单细胞RNA测序（scRNA-seq）与空间转录组学
全面解析PAD和非缺血肌肉中的细胞类型组成和转录特征。
对4例PAD和4例非缺血性患者的肌肉进行scRNA-seq，并对3例每组的样本进行CosMx空间转录组学检测，整合数据并进行细胞聚类和注释。
内皮细胞亚型分析及验证
鉴定和表征人类骨骼肌中的EC亚型，特别是ATF3/ATF4+亚型及其在PAD中的变化。
从scRNA-seq数据中提取EC进行亚聚类，通过差异表达、ORA、SCENIC和GSVA分析，鉴定ATF3/ATF4+ EC亚型，并分析其在PAD中的转录变化。
体内功能验证：内皮特异性Atf4敲除小鼠后肢缺血模型
验证ATF4信号在内皮细胞中对缺血后血流恢复和血管新生的必要性。
对Atf4ECKO（Pdgfb-CreERT2×Atf4fl/fl）和对照小鼠进行后肢缺血手术，监测血流恢复，并在不同时间点分析肌肉损伤、血管密度和EC增殖。
巨噬细胞亚型分析及功能表征
鉴定肌肉中巨噬细胞亚型，并分析PAD中LYVE1hiMHCIIlow巨噬细胞的表型变化。
从scRNA-seq数据中提取MoMac群体进行亚聚类，分析LYVE1hiMHCIIlow巨噬细胞的比例、差异表达基因及功能通路，并通过空间转录组分析其与EC的空间关系。
细胞间通讯分析
研究PAD过程中肌肉微环境中细胞间通讯的变化。
使用CellChat分析所有细胞类型间的配体-受体相互作用，并使用NicheNet分析ATF3/ATF4+ EC与LYVE1hi巨噬细胞之间的通讯及下游调控网络。
体外功能验证：EC条件培养基对巨噬细胞极化的影响
验证PAD来源的EC分泌因子能否影响单核细胞向巨噬细胞的分化方向。
收集非缺血（n=3）和PAD（n=5）原代肌肉EC的条件培养基，与健康供体CD14+细胞共培养3天，通过流式细胞术检测CD206、CD80和HLA-DR表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
样本处理与组织学
细胞间通讯分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 组织保存 | HypoThermosol FRS保存液 | Sigma-Aldrich | H4416 |
| 组织消化 | 分散酶II | Sigma-Aldrich | D4693 |
| IV型胶原酶 | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | |
| HBSS缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | 14025100 | |
| 热灭活胎牛血清 | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | |
| EDTA | VWR Life Science | E177 | |
| 100 μm细胞筛网 | Bioswisstec | 800100 | |
| 40 μm细胞筛网 | Falcon | 352340 | |
| ACK裂解缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | A1049201 | |
| 细胞分选 | 牛血清白蛋白 | PanReac AppliChem | A1391 |
| 杜氏磷酸盐缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | |
| 钙黄绿素紫 | Thermo Fisher Scientific | 65-0854-39 | |
| scRNA-seq | 10x Chromium Next GEM微流控芯片G | 10x Genomics | -- |
| 10x Chromium Next Gem单细胞3'试剂盒3.1版 | 10x Genomics | CG000204 | |
| Illumina NovaSeq 6000系统 | Illumina | -- | |
| EC分离与培养 | EGM-2 MV微血管内皮细胞生长培养基-2套装 | Lonza | CC-3202 |
| 药物处理 | 雷公藤红素 | Sigma-Aldrich | C0869 |
| 二甲基亚砜 | Carl Roth | A994.1 | |
| RNA提取 | RNeasy Plus Micro试剂盒 | Qiagen | 74034 |
| RNA质量评估 | Agilent高灵敏度RNA ScreenTape系统 | Agilent | -- |
| 条件培养基制备 | 0.2 μm滤器 | Sarstedt | 83.1826.001 |
| PBMC分离 | Ficoll-Paque PLUS | Cytiva | 17-1440-02 |
| CD14+细胞分离 | 人CD14微磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-050-201 |
| 细胞培养 | 48孔板 | TPP | TPP92148 |
| 流式分析 | Human TruStain FcX | BioLegend | 422302 |
| Zombie NI可固定活力试剂盒 | BioLegend | 423106 | |
| CD14抗体（APC-Cy7） | BioLegend | 325620 | |
| CD19抗体（FITC） | BD Biosciences | 555412 | |
| CD3抗体（BV650） | BioLegend | 300468 | |
| CD56抗体（PC5） | Beckman Coulter | A07789 | |
| HLA-DR抗体（BV605） | BD Biosciences | 562845 | |
| CD80抗体（FITC） | BD Biosciences | 557226 | |
| CD206抗体（PE） | BioLegend | 321106 | |
| bulk RNA-seq | TruSeq链式mRNA文库试剂盒 | Illumina | -- |
| Illumina NovaSeq X Plus | Illumina | -- | |
| 空间转录组学 | CosMx人类通用细胞表征panel（RNA，1000重） | NanoString | CMX-H-USCP-1KP-R |
| 免疫荧光染色 | 抗LYVE1抗体 | Abcam | ab33682 |
| 抗CD68抗体 | Abcam | ab955 | |
| 抗CD31抗体 | Dako | M082329-2 | |
| 抗纤连蛋白抗体 | Abcam | ab23750 | |
| 山羊抗兔IgG二抗，Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | |
| 山羊抗小鼠IgG二抗，Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-1101 | |
| Alexa Fluor 647偶联麦胚凝集素（WGA） | Thermo Fisher Scientific | W32466 | |
| Hoechst | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Immu-Mount封片剂 | Thermo Fisher Scientific | 9990412 | |
| AxioObserver.Z1荧光显微镜 | Zeiss | -- | |
| 组织学 | Eclipse Ti2倒置显微镜 | Nikon | -- |
| 小鼠实验 | 他莫昔芬 | Sigma-Aldrich | T5648 |
| 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU） | Thermo Fisher Scientific | E10187 | |
| 激光多普勒成像设备 | Moor Instruments | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 患者样本收集 | PAD患者和非缺血性患者的纳入排除标准、年龄、性别、合并症及药物使用情况。 阅读提示：Methods: Patients and study design; Table 1 |
| scRNA-seq | 细胞分离方法、消化酶浓度和时间、FACS分选标记、10x Chromium芯片类型及单细胞3'试剂盒版本、测序平台、生物信息学分析流程（包括质量控制阈值和整合方法）。 阅读提示：Methods: Isolation of cells from human skeletal muscle for scRNA-seq; Human scRNA-seq analysis |
| 空间转录组学 | 使用的切片厚度、CosMx panel类型、细胞分割方法（DAPI和laminin）及数据整合和标签转移的流程。 阅读提示：Methods: CosMx single-cell spatial transcriptomics of muscle tissue |
| EC分离与药物处理 | EC分离方法（CD31磁珠分选）、培养条件、celastrol浓度（125nM和250nM）及处理时间（24小时），作用溶剂DMSO体积。 阅读提示：Methods: Isolation and culture of ECs from human skeletal muscle |
| 体外巨噬细胞极化 | 条件培养基制备方法、CD14+细胞分离方法、培养条件（细胞密度、培养基体积）、条件培养基浓度梯度（0%-50%）、培养时间（3天）、流式抗体克隆和稀释度。 阅读提示：Methods: Macrophage polarization in vitro using conditioned media; Fig. 7e legend |
| 小鼠HLI模型 | 小鼠品系（C57BL/6N）、基因型（Pdgfb-CreERT2×Atf4fl/fl）、他莫昔芬诱导方案（剂量、注射途径和天数）、HLI手术方法（结扎和切除血管段）、血流测量时间点、组织分析时间点。 阅读提示：Methods: Mice; HLI model; Extended Data Fig. 3 legend |