新生小鼠放血诱导贫血的肝脏免疫图谱

Immune landscape in liver of neonatal mice with phlebotomy-induced anemia

作者信息Balamurugan Ramatchandirin, Wenjia Wang, Marie Amalie Balamurugan, Yasemin Alnahhas, Suneetha Desiraju, Arjun Subrramanya, Juanitaa George Raj, Zainab D Lawal, Megan Ferris, George Tseng, Liza Konnikova, Krishnan MohanKumar
PMID40962864
发布时间2026-03
DOI10.1038/s41390-025-04361-x

实验完整度

包含单细胞RNA测序、流式细胞术验证、差异表达及通路分析等多个证据层级,并进行功能表型验证。

主要模型

C57BL/6新生小鼠(P1-P11) 放血诱导贫血(PIA)小鼠模型

重点核对

动物模型:C57BL/6小鼠,出生后P2、P4、P6、P8、P10进行面部静脉放血,20 μL/g体重 对照组:非放血但每日针刺的假处理 样本量:每组6只小鼠(n=6/组) scRNA-seq:每样本约20,000个细胞,10x Genomics Chromium Next GEM Single-Cell 3' Reagent Kits v3.1,Illumina NovaSeq 6000测序 流式细胞术:抗体组合(CD45, CD11b, Ly6C, F4/80, Ly6G, CD11c, CD3, CD20, CD49B)

摘要

背景:严重贫血是新生儿重症监护病房早产儿常见的合并症,由放血、促红细胞生成素水平低、红细胞寿命短所致,并因潜在的造血不成熟而加剧。贫血引起组织缺氧,可能改变肝脏中的造血龛。本研究利用我们的临床前小鼠放血诱导贫血(PIA)模型来研究肝脏中的免疫细胞图谱。方法:对C57BL/6小鼠在出生后第2至10天进行定时放血以诱导严重贫血。通过单细胞RNA测序和流式细胞术表征贫血肝脏中的免疫细胞。结果:scRNA-seq分析显示,PIA与新生小鼠肝脏免疫景观的改变相关。我们发现在贫血肝脏中Ly6C2+单核细胞和Gypa+红细胞增多,淋巴细胞(CD20+ [MS4a1] B细胞和T细胞)减少。对单核细胞的进一步分析揭示了促炎和高趋化性表型,而红细胞则表现出炎症标志物下调和成熟缺陷。淋巴细胞(B和T细胞)表现出脂质代谢过程受抑制,包括类固醇和激素代谢。结论:新生小鼠PIA与粒系造血(特别是单核系造血)和红系造血相关,同时抑制肝脏中的淋巴造血。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
放血诱导贫血是否改变新生小鼠肝脏的免疫细胞发育和组成?
核心机制
PIA促进肝脏粒系造血(特别是单核系)和应激性红系造血,同时抑制淋巴造血,可能与组织缺氧和炎症通路激活有关。
主要证据
scRNA-seq和流式细胞术显示贫血肝脏中Ly6C2+单核细胞和Gypa+红细胞增多,B细胞和T细胞减少;单核细胞呈促炎和趋化表型,红细胞存在成熟缺陷,淋巴细胞脂质代谢受抑制。
研究意义
揭示贫血时肝脏的应急性粒系造血、应激性红系造血和淋巴细胞缺乏,为早产儿贫血的治疗开发提供新见解。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

诱导贫血模型

建立新生小鼠放血诱导贫血模型,模拟早产儿贫血

对C57BL/6新生小鼠在P2、P4、P6、P8、P10进行面部静脉放血(20 μL/g体重),以降低红细胞压积至20-24%;对照组每日针刺但不放血。

2

肝脏单细胞悬液制备与scRNA-seq

表征贫血和对照肝脏的免疫细胞组成和转录组

P11处死小鼠,取肝脏组织,用小鼠肝脏解离试剂盒和gentleMACS Dissociator制备单细胞悬液,使用10x Genomics平台构建单细胞转录组文库,并在Illumina NovaSeq 6000上测序。

3

scRNA-seq数据分析

鉴定免疫细胞类型、差异表达基因和富集通路

使用Seurat包进行数据整合、聚类和注释;使用pseudobulk和voom-limma进行差异表达分析;使用GSEA进行通路富集分析。

4

流式细胞术验证

验证scRNA-seq发现的免疫细胞比例变化

对肝脏单细胞悬液进行多色流式细胞术,使用抗体标记CD45, CD11b, Ly6C, F4/80, Ly6G, CD11c, CD3, CD20, CD49B。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

验证模型特征
分析免疫细胞组成

产品清单

实验环节名称品牌货号
C57BL/6J繁殖小鼠JAX000664
Cellpak试剂Sysmex AmericaDCL-310A
Sysmex XT-2000iV兽用血液分析仪Sysmex--
小鼠肝脏解离试剂盒Miltenyi Biotech130-105-807
gentleMACS组织解离器Miltenyi Biotech130-093-235
Liberase酶消化液----
HepatoZYME培养基----
DNA酶I----
胎牛血清----
台盼蓝Millipore SigmaT6146
Cellometer AutoT4细胞计数仪Nexcelom Bioscience--
Chromium Next GEM单细胞3'试剂盒v3.110x Genomics--
Illumina NovaSeq 6000测序仪Illumina--
细胞染色缓冲液BioLegend420201
Fc受体封闭试剂Miltenyi Biotec130-092-575
L-D活力染料Thermo FisherL34957
CD45抗体BioLegend30-F11
CD11b抗体BioLegendM1/70
Ly6C抗体BioLegendHK1.4
F4/80抗体BioLegendBM8
Ly6G抗体BioLegend1A8
CD11c抗体BioLegendN418
CD3抗体BioLegend17A2
CD20抗体BioLegend2H7
CD49B抗体BioLegendHMα2
BD LSR-II流式细胞仪Becton Dickinson--
FlowJo 10.5.3软件Becton Dickinson--
GraphPad Prism 10软件GraphPad--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
动物模型
小鼠品系:C57BL/6J;放血时间点:P2, P4, P6, P8, P10;放血量:20 μL/g体重;对照组每日针刺
阅读提示:Methods: Animals and Animal model
肝脏组织解离
解离试剂盒:小鼠肝脏解离试剂盒(Miltenyi Biotec);消化条件:Liberase酶消化液,37°C,200 RPM,30分钟
阅读提示:Methods: Liver tissue dissociation
scRNA-seq
上样细胞数:约20,000细胞/样本;试剂盒:Chromium Next GEM Single-Cell 3' Reagent Kits v3.1;测序:Illumina NovaSeq 6000,50,000 reads/细胞
阅读提示:Methods: Single-cell RNA library preparation and sequencing
流式细胞术
抗体组合:CD45, CD11b, Ly6C, F4/80, Ly6G, CD11c, CD3, CD20, CD49B;稀释度:1:25;仪器:BD LSR-II
阅读提示:Methods: Flow cytometry
数据分析
过滤标准:UMI <500或>50,000,线粒体>50%;差异表达:pseudobulk + voom-limma;通路分析:GSEA with GO
阅读提示:Methods: Analysis of RNA-sequencing data, Differential expression analysis, Gene set enrichment analysis