诱导贫血模型
建立新生小鼠放血诱导贫血模型,模拟早产儿贫血
对C57BL/6新生小鼠在P2、P4、P6、P8、P10进行面部静脉放血(20 μL/g体重),以降低红细胞压积至20-24%;对照组每日针刺但不放血。
Immune landscape in liver of neonatal mice with phlebotomy-induced anemia
包含单细胞RNA测序、流式细胞术验证、差异表达及通路分析等多个证据层级,并进行功能表型验证。
C57BL/6新生小鼠(P1-P11) 放血诱导贫血(PIA)小鼠模型
动物模型:C57BL/6小鼠,出生后P2、P4、P6、P8、P10进行面部静脉放血,20 μL/g体重 对照组:非放血但每日针刺的假处理 样本量:每组6只小鼠(n=6/组) scRNA-seq:每样本约20,000个细胞,10x Genomics Chromium Next GEM Single-Cell 3' Reagent Kits v3.1,Illumina NovaSeq 6000测序 流式细胞术:抗体组合(CD45, CD11b, Ly6C, F4/80, Ly6G, CD11c, CD3, CD20, CD49B)
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
建立新生小鼠放血诱导贫血模型,模拟早产儿贫血
对C57BL/6新生小鼠在P2、P4、P6、P8、P10进行面部静脉放血(20 μL/g体重),以降低红细胞压积至20-24%;对照组每日针刺但不放血。
表征贫血和对照肝脏的免疫细胞组成和转录组
P11处死小鼠,取肝脏组织,用小鼠肝脏解离试剂盒和gentleMACS Dissociator制备单细胞悬液,使用10x Genomics平台构建单细胞转录组文库,并在Illumina NovaSeq 6000上测序。
鉴定免疫细胞类型、差异表达基因和富集通路
使用Seurat包进行数据整合、聚类和注释;使用pseudobulk和voom-limma进行差异表达分析;使用GSEA进行通路富集分析。
验证scRNA-seq发现的免疫细胞比例变化
对肝脏单细胞悬液进行多色流式细胞术,使用抗体标记CD45, CD11b, Ly6C, F4/80, Ly6G, CD11c, CD3, CD20, CD49B。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物模型 | C57BL/6J繁殖小鼠 | JAX | 000664 |
| Cellpak试剂 | Sysmex America | DCL-310A | |
| Sysmex XT-2000iV兽用血液分析仪 | Sysmex | -- | |
| 肝脏组织解离 | 小鼠肝脏解离试剂盒 | Miltenyi Biotech | 130-105-807 |
| gentleMACS组织解离器 | Miltenyi Biotech | 130-093-235 | |
| Liberase酶消化液 | -- | -- | |
| HepatoZYME培养基 | -- | -- | |
| DNA酶I | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 台盼蓝 | Millipore Sigma | T6146 | |
| Cellometer AutoT4细胞计数仪 | Nexcelom Bioscience | -- | |
| scRNA-seq | Chromium Next GEM单细胞3'试剂盒v3.1 | 10x Genomics | -- |
| Illumina NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- | |
| 流式细胞术 | 细胞染色缓冲液 | BioLegend | 420201 |
| Fc受体封闭试剂 | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| L-D活力染料 | Thermo Fisher | L34957 | |
| CD45抗体 | BioLegend | 30-F11 | |
| CD11b抗体 | BioLegend | M1/70 | |
| Ly6C抗体 | BioLegend | HK1.4 | |
| F4/80抗体 | BioLegend | BM8 | |
| Ly6G抗体 | BioLegend | 1A8 | |
| CD11c抗体 | BioLegend | N418 | |
| CD3抗体 | BioLegend | 17A2 | |
| CD20抗体 | BioLegend | 2H7 | |
| CD49B抗体 | BioLegend | HMα2 | |
| BD LSR-II流式细胞仪 | Becton Dickinson | -- | |
| FlowJo 10.5.3软件 | Becton Dickinson | -- | |
| 统计分析 | GraphPad Prism 10软件 | GraphPad | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | 小鼠品系:C57BL/6J;放血时间点:P2, P4, P6, P8, P10;放血量:20 μL/g体重;对照组每日针刺 阅读提示:Methods: Animals and Animal model |
| 肝脏组织解离 | 解离试剂盒:小鼠肝脏解离试剂盒(Miltenyi Biotec);消化条件:Liberase酶消化液,37°C,200 RPM,30分钟 阅读提示:Methods: Liver tissue dissociation |
| scRNA-seq | 上样细胞数:约20,000细胞/样本;试剂盒:Chromium Next GEM Single-Cell 3' Reagent Kits v3.1;测序:Illumina NovaSeq 6000,50,000 reads/细胞 阅读提示:Methods: Single-cell RNA library preparation and sequencing |
| 流式细胞术 | 抗体组合:CD45, CD11b, Ly6C, F4/80, Ly6G, CD11c, CD3, CD20, CD49B;稀释度:1:25;仪器:BD LSR-II 阅读提示:Methods: Flow cytometry |
| 数据分析 | 过滤标准:UMI <500或>50,000,线粒体>50%;差异表达:pseudobulk + voom-limma;通路分析:GSEA with GO 阅读提示:Methods: Analysis of RNA-sequencing data, Differential expression analysis, Gene set enrichment analysis |