建立心脏损伤模型
诱导心脏损伤，模拟心肌梗死。
对成年小鼠进行LAD结扎或冷冻消融手术，造成心室损伤。
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损伤修复过程中心脏免疫微环境的时空动态变化
Spatiotemporal dynamics of the cardioimmune niche during lesion repair
实验完整度
高包含了单细胞测序、空间转录组、体外细胞培养、类器官培养、人类心脏切片培养，以及体内动物模型等多个独立证据层级，并进行了功能验证。
主要模型
成年小鼠心脏损伤模型（LAD结扎和冷冻消融） 新生小鼠心肌细胞（P7） 骨髓来源巨噬细胞（BMDM） 人类心脏切片
重点核对
小鼠模型：C57BL/6J雌性小鼠，12周龄，LAD结扎或冷冻消融。 损伤时间点：1、3、7、28、56天。 单细胞测序细胞数：84,961个细胞/核。 空间转录组：Xenium平台，475个基因。 细胞培养条件：BMDM培养，IL-4处理，GAS6处理等。
摘要
心脏是人体再生能力最差的器官之一，缺血性心脏病是全球主要的死亡原因。了解心肌组织损伤后心脏创面愈合过程中发生的细胞和分子过程，是减轻健康负担和改善心肌损伤后心脏功能的重要前提。在此，通过将单细胞RNA测序与高分辨率空间转录组学相结合，我们重建了成年小鼠心脏损伤后纤维化微环境的时空动态。我们揭示了一个调节心脏修复的复杂多细胞网络，包括Trem2高表达巨噬细胞对成纤维细胞增殖的沉默，以防止过度纤维化。我们进一步发现在损伤后存在一群罕见的祖细胞样心肌细胞，由髓系和淋巴样微环境信号促进。用这些微环境因子培养非再生小鼠心肌细胞或人心脏组织，可重新激活祖细胞基因表达和细胞周期活性。总之，这一时空图谱为控制心脏修复的异细胞相互作用提供了有价值的见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 心脏损伤后纤维化瘢痕形成过程中，不同细胞类型如何在时空上相互作用，以及这些相互作用如何影响心脏修复？
- 核心机制
- Trem2高表达巨噬细胞通过GAS6-PROS1/AXL信号抑制成纤维细胞增殖，成纤维细胞通过SEMA3D-NRP1/PLXNA4信号抑制巨噬细胞增殖；IL-4从TH2细胞分泌促进巨噬细胞从促炎状态向Trem2高表达状态转变；BMP-7、TWEAK和IL-1β协同诱导心肌细胞去分化。
- 主要证据
- 通过单细胞测序和空间转录组分析，结合免疫荧光、流式细胞术和体外细胞培养实验，验证了巨噬细胞-成纤维细胞互作和心肌细胞去分化。
- 研究意义
- 提供了心脏损伤后修复过程的时空图谱，揭示了新的细胞互作机制，为开发促进心脏修复和再生的治疗策略提供了潜在的靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
单细胞转录组分析
鉴定心脏损伤后不同细胞类型及其状态变化。
分离心肌细胞和非心肌细胞，进行单细胞RNA测序和单核RNA测序。
空间转录组分析
绘制损伤区域细胞空间分布和细胞间相互作用。
使用Xenium平台对心脏切片进行原位测序，进行空间转录组分析。
体外细胞功能验证
验证特定配体-受体相互作用的功能。
培养小鼠心肌细胞和成纤维细胞，用重组蛋白（如GAS6、PROS1、SEMA3D、BMP-7、TWEAK、IL-1β）处理，检测细胞增殖、去分化等表型。
人类心脏组织验证
验证小鼠中发现的机制在人类心脏中是否保守。
培养人类心脏切片，用BMP-7、TWEAK和IL-1β组合（BIT）处理，检测心肌细胞去分化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 组织处理 | 蛋白酶K | Sigma-Aldrich | -- |
| Liberase TL研究级 | Hoffmann-La Roche | -- | |
| 细胞分选 | CD45-Pacific Blue | BioLegend | 103125 |
| Ter119-APC/Cy7 | BioLegend | 116223 | |
| CD31-PE | BioLegend | 102507 | |
| CD146-PE | BioLegend | 134703 | |
| CD14-FITC | BioLegend | 123307 | |
| CD11c-APC | BioLegend | 117309 | |
| Zombie-NIR活力染料 | BioLegend | 423105 | |
| TruStain FcX | BioLegend | 101319 | |
| 小鼠RNase抑制剂 | New England Biolabs | M0314L | |
| PCM1抗体 | MERCK | HPA023370 | |
| 单核分离 | Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 |
| 台盼蓝溶液 | Thermo Fisher | 15250061 | |
| 测序 | Chromium Next GEM Single Cell 3'试剂盒v.3.1 | 10x Genomics | PN-1000268 |
| Nextseq2000 | Illumina | -- | |
| 空间转录组学 | Xenium分析仪 | 10x Genomics | -- |
| 麦胚凝集素 | Biozol | BOT-29026-1 | |
| DAPI | -- | -- | |
| CD14抗体 | Proteintech | 60253-1-IG | |
| RPS9抗体 | Invitrogen | PA5-104493 | |
| 抗小鼠Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11077 | |
| 抗兔Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11055 | |
| 细胞培养 | 新生心脏解离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-098-373 |
| 新生心肌细胞分离抗体混合物 | Miltenyi | 130-100-825 | |
| CD140a抗体 | Thermo Fisher | 13-1401-82 | |
| MojoSort链霉亲和素纳米磁珠 | BioLegend | 480016 | |
| 重组小鼠IL-1β | BioLegend | 575102 | |
| 重组人TWEAK | BioLegend | 566402 | |
| 重组小鼠BMP-7蛋白 | R&D Systems | 5666-BP-010/CF | |
| 重组小鼠GAS6蛋白 | R&D Systems | 986-GS-025/CF | |
| 重组小鼠蛋白S/PROS1 | R&D Systems | 9740-PS-050/CF | |
| 重组人TGF-β1 | BioLegend | 781802 | |
| 重组人Gas6蛋白 | R&D Systems | 885-GSB-050 | |
| 重组人BMP-7蛋白 | BioLegend | 595601 | |
| SEMA3D | R&D Systems | 9386-S3-025/CF | |
| 抗CD3 | BioXCell | BE0001-1 | |
| 抗CD28 | BioXCell | BE0015-1 | |
| 抗IFNγ | Thermo Scientific | 315-05 | |
| 重组人IL-2 | Thermo Scientific | 200-02 | |
| 重组小鼠IL-4 | Thermo Scientific | AF-214-14 | |
| IFNγ | -- | -- | |
| IL-4 | -- | -- | |
| 流式细胞术 | Mki67-FITC抗体 | BioLegend | 151211 |
| CD140a-PE抗体 | Thermo Fisher | 12-1401-81 | |
| αSMA一抗 | Invitrogen | 14-9760-80 | |
| 肌动蛋白（肌节）-PE | Miltenyi | 130-123-996 | |
| AuroraB一抗 | BD Bioscience | 611082 | |
| 山羊抗小鼠IgG-AF647 | BioLegend | 405322 | |
| 免疫荧光 | PDGFRa抗体 | R&D Systems | AF1062-SP |
| CD45抗体 | BioLegend | 103108 | |
| CD11b抗体 | Invitrogen | MA5-17857 | |
| GAS6抗体 | R&D Systems | AF986-SP | |
| PROS1抗体 | Invitrogen | PA5-106880 | |
| AXL抗体 | R&D Systems | AF854-SP | |
| BMP-7抗体 | NovusBio | NBP2-52425 | |
| GATA3抗体 | Invitrogen | 14-9966-82 | |
| KIT抗体 | R&D Systems | AF1356-SP | |
| 组蛋白H3抗体 | Abcam | ab14955 | |
| 山羊抗小鼠IgG Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A32728 | |
| PCR | PicoPure RNA提取试剂盒 | Applied Biosystems | KIT0204 |
| RevertAid H Minus第一链cDNA合成试剂盒 | Thermo Scientific | K1632 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725120 | |
| CFX Connect实时荧光定量PCR检测系统 | Bio-Rad | 1855201 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | 小鼠品系、性别、年龄、手术方式（LAD结扎或冷冻消融）、麻醉和术后护理。 阅读提示：Methods：Mouse cardiac surgery |
| 单细胞/单核测序 | 组织取样区域（IZ/BZ/RZ）、酶消化时间、FACS分选策略、10x Chromium建库参数。 阅读提示：Methods：Tissue processing and cell isolation、NM antibody labeling and FACS sorting |
| 空间转录组 | 组织固定和包埋方法、切片厚度、Xenium基因panel（475个基因）、解码和质控参数。 阅读提示：Methods：Spatial transcriptomics sample processing、imaging and preprocessing |
| 细胞培养 | 细胞类型（原代心肌细胞、成纤维细胞、BMDM）、分离方法、培养条件、重组蛋白浓度和处理时间。 阅读提示：Methods：Mouse primary CM culturing、Mouse primary cardiac FB and myoFB culturing、BMDM culture and polarization |
| 体外验证实验 | 重组蛋白（IL-1β、TWEAK、BMP-7、GAS6、PROS1、SEMA3D）的浓度、处理时间、检测指标（Mki67、AuroraB、Actc1等）。 阅读提示：Methods：Functional validation experiments |