样本收集和单细胞测序
获取患者肝脏FNA和外周血细胞，进行单细胞转录组分析。
从25例MASLD/MASH患者收集肝脏FNA和PBMC，立即进行单细胞RNA测序，共获得168,634个细胞。
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人类肝脏和血液免疫细胞在脂肪性肝病各阶段的单细胞图谱揭示了与肝功能障碍和纤维化相关的独特特征
Single-cell atlas of human liver and blood immune cells across fatty liver disease stages reveals distinct signatures linked to liver dysfunction and fibrogenesis
实验完整度
高涉及患者队列、单细胞测序、免疫荧光和免疫组化验证，以及小鼠模型，包含多个独立证据层级和功能验证。
主要模型
人类MASLD/MASH患者队列（n=25） 肝脏FNA和PBMC样本 HF-CDAA饮食诱导的C57BL/6J小鼠MASH模型
重点核对
患者队列：25例MASLD/MASH患者，包括NS、SS、早期MASH（F0-F1）和晚期MASH（F2-F4）分组 样本：配对肝脏FNA和PBMC，FNA无需消化，细胞活力>95% 测序：10x Genomics单细胞3'试剂盒v3.1，CellRanger v2.1.1比对至GRCh38 免疫荧光验证：FFPE肝切片使用CD68、S100A9、MX1、IFIT3抗体 小鼠实验：雄性C57BL/6J小鼠，HF-CDAA饮食4、8、12周
摘要
免疫细胞在代谢功能障碍相关脂肪性肝病和代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASLD/MASH）中发挥核心但尚不明确的作用，这是一种全球性的肝病病因，治疗手段有限。由于人类肝脏样本获取受限以及缺乏跨MASLD/MASH分期的研究，阻碍了分期特异性免疫靶点的鉴定。在此，我们提供了一个涵盖MASLD/MASH全谱系人类队列的配对外周血和肝脏细针穿刺样本的单细胞RNA测序图谱。我们的发现包括随MASH进展而增强的免疫调节程序，例如肝内调节性T细胞、单核细胞源性髓系抑制细胞、TREM2+S100A9+巨噬细胞和S100hiHLAlo 2型常规树突状细胞的富集。肝内细胞毒性T细胞功能随炎症增加而增强，但随纤维化而减弱，同时获得耗竭表型，而自然杀伤细胞驱动的毒性增强。我们的数据集提出了MASH中纤维化增加以及对肝癌和感染易感性增加的免疫学机制，为深入理解慢性肝病中人类免疫功能障碍提供了基础，也为新的靶向治疗提供了路线图。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 免疫细胞在不同MASLD/MASH阶段如何变化，以及它们与肝功能障碍和纤维化的关系是什么？
- 核心机制
- MASH进展伴随免疫调节细胞（Treg、M-MDSC、S100A9+巨噬细胞、S100hiHLAlo cDC2）富集，细胞毒性T细胞耗竭，NK细胞毒性增强，这些共同促进纤维化和免疫逃逸。
- 主要证据
- 基于25例患者配对肝脏FNA和PBMC的单细胞转录组分析，鉴定出多种免疫细胞亚群，并通过免疫荧光和免疫组化验证S100A9+巨噬细胞和T细胞活化标志物。
- 研究意义
- 该数据集为理解慢性肝病中人类免疫功能障碍提供了基础，并为新的靶向抗纤维化治疗提供了路线图。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
单细胞数据质量控制和聚类
识别主要免疫细胞类型并评估其比例变化。
使用CellRanger、Seurat、Harmony进行数据预处理和批次校正，通过UMAP聚类鉴定17种主要细胞类型，并比较不同疾病阶段的细胞比例。
单核细胞亚群分析
探究单核细胞异质性及其与MASH进展的关系。
对单核细胞、巨噬细胞和cDC进行亚聚类，得到5个单核细胞亚群，并分析其在肝和血中的比例变化及分化轨迹。
巨噬细胞和树突状细胞分析
鉴定巨噬细胞和DC亚群及其与纤维化的关联。
对巨噬细胞、cDC和pDC进行亚聚类，发现S100A9+巨噬细胞和S100hiHLAlo cDC2在晚期MASH中富集，并通过免疫荧光和免疫组化验证。
T细胞和NK细胞分析
揭示T细胞和NK细胞亚群及其功能状态随MASH的变化。
对T细胞和NK细胞进行亚聚类，鉴定14个T细胞亚群和7个NK细胞亚群，并通过NMF分析功能程序，发现T细胞耗竭和NK细胞毒性增强。
细胞间通讯分析
探究肝内免疫细胞与HSC之间的相互作用。
使用CellChat推断配体-受体相互作用，发现单核细胞是主要通讯驱动者，HSC与免疫细胞的相互作用随疾病阶段变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 样本采集 | Chiba针 | -- | 25G |
| 细胞分离 | EasySep红细胞去除试剂 | STEMCELL Technologies | 18170 |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare Life Sciences | -- | |
| 细胞活力检测 | 台盼蓝 | Thermo Fisher Scientific | 15250061 |
| 单细胞测序 | Chromium仪器 | 10x Genomics | -- |
| Next GEM单细胞3'试剂盒 | 10x Genomics | v.3.1 | |
| 文库质量控制 | Tapestation 4200 | Agilent Technologies | -- |
| 测序 | NextSeq 2000 | Illumina | -- |
| 多重免疫荧光 | Opal三色手动检测试剂盒 | Akoya | NEL810001KT |
| CD68兔多克隆抗体 | Abcam | 125157 | |
| S100A9 (D5O6O)兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 34425 | |
| MX1 (D3W7I)兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 37849 | |
| IFIT3兔多克隆抗体 | Proteintech | 15201-1-AP | |
| 免疫荧光封片 | ProLong Gold抗淬灭封片剂（含DAPI） | Invitrogen | P36935 |
| 成像 | EVOS M7000成像系统 | Invitrogen | AMF7000 |
| 数据分析 | Celleste 6图像分析软件 | Invitrogen | AMEP4942 |
| 图像分析 | ImageJ软件 | -- | v.1.53t |
| 小鼠免疫组化 | S100A9兔单克隆抗体（D3U8M） | Cell Signaling Technology | 73425 |
| 血清标志物检测 | Quantikine ELISA | R&D Systems | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本收集 | 患者队列：25例，MASLD/MASH全谱系，包括NS、SS、早期MASH、晚期MASH；配对肝脏FNA和PBMC；FNA需无消化处理 阅读提示：Methods: Characteristics of patients with MASLD 和 Sample collections and FNA procedures |
| 单细胞文库制备 | 10x Genomics单细胞3'试剂盒v3.1；目标捕获10000细胞；细胞浓度1000 cells/μL 阅读提示：Methods: Library preparation and sequencing |
| 单细胞数据分析 | 过滤标准：线粒体含量<35%，基因数>300，UMI>1000；聚类参数：主成分数和分辨率 阅读提示：Methods: ScRNA-seq analyses 和图例 |
| 免疫荧光验证 | FFPE肝切片；抗体：CD68、S100A9、MX1、IFIT3；稀释比例和孵育时间：CD68 1:100、S100A9 1:400、MX1 1:160、IFIT3 1:100，4°C过夜 阅读提示：Methods: Liver tissue multiplex immunofluorescence |
| 小鼠模型 | 雄性C57BL/6J小鼠，起始8周龄；HF-CDAA饮食；时间点：4、8、12周；对照组：正常饮食 阅读提示：Methods: Murine liver tissue immunohistochemistry |