hBMMSC sEVs提取与鉴定
获取并验证hBMMSC sEVs的形态、大小和表面标志物
通过梯度超速离心从hBMMSC上清中提取sEVs，使用透射电镜观察形态，纳米流式分析检测粒径和CD9/CD63表达。
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小细胞外囊泡治疗小梁网纤维化：2D/3D体外和体内分析
Small Extracellular Vesicle Treatment of Trabecular Meshwork Fibrosis: 2D/3D In Vitro and In Vivo Analyses
实验完整度
高包含体外2D/3D细胞模型、动物模型等多个独立证据层级，并通过Western blot、免疫荧光、qPCR、形态学分析及IOP测量进行功能与机制验证。
主要模型
原代人小梁网细胞（hTMCs）2D培养 无支架3D培养的小梁网细胞球体 TGFβ2过表达腺病毒诱导的慢性高眼压小鼠模型
重点核对
hBMMSC sEVs的提取与鉴定：梯度超速离心，粒径40-160 nm，CD9/CD63阳性 TGFβ2诱导纤维化模型：20 ng/mL TGFβ2处理24小时 sEVs处理浓度：108 particles/mL，处理24小时 3D培养条件：无支架3D培养6天，随后处理24小时 动物模型：腺病毒Ad-TGFβ2C226/228S前房注射，14天后注射108/mL sEVs
摘要
目的：小梁网（TM）纤维化是POAG的关键病理机制。小细胞外囊泡（sEVs）是一种细胞外分泌物，具有抗纤维化和损伤修复等多种功能。本研究探讨了人骨髓间充质干细胞来源（hBMMSC）sEVs在二维（2D）/三维（3D）培养的TM细胞体外及体内的抗纤维化作用。方法：从角膜环中分离原代人TM细胞并鉴定。通过无支架3D培养生成3D TM培养物。通过梯度超速离心从hBMMSC上清中提取sEVs，并通过电子显微镜和纳米流式分析进行鉴定。在2D/3D TM细胞培养中建立TGFβ2诱导的纤维化模型，通过Western blot、免疫荧光和形态学分析评估sEVs处理的效果。通过注射过表达TGFβ2的腺病毒Ad-TGFβ2C226/228S构建慢性高眼压小鼠模型。2周后将hBMMSC sEVs注射入前房。测定眼压（IOP）以及虹膜角膜角中纤连蛋白（FN）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的变化。结果：hBMMSC sEVs在2D和3D TM纤维化模型中均显著降低FN和α-SMA表达。sEVs还减轻了TGFβ2诱导的3D培养TM体积、孔隙率和孔隙密度的降低。在体内，注射sEVs有效降低了TGFβ2诱导的IOP升高，并减少了虹膜角膜角中FN和α-SMA的表达。结论：hBMMSC sEVs通过蛋白表达和形态学变化显著减轻TGFβ2诱导的TM纤维化。此外，hBMMSC sEVs在缓解与TM纤维化相关的TGFβ2诱导的IOP升高方面具有治疗潜力。关键词：青光眼，小梁网，sEVs，纤维化，3D培养
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- hBMMSC sEVs能否减轻TGFβ2诱导的小梁网纤维化并降低眼压？
- 核心机制
- hBMMSC sEVs通过上调MMP3表达和下调TIMP1表达，增加MMP3/TIMP1比值，促进ECM降解，从而减轻TM纤维化。
- 主要证据
- 在2D和3D培养的TM细胞中，sEVs显著降低FN和α-SMA的表达，并改善3D结构形态；在体内，sEVs注射降低TGFβ2诱导的IOP升高并减少FN和α-SMA表达。
- 研究意义
- hBMMSC sEVs具有治疗POAG相关TM纤维化和降低IOP的潜力，为青光眼治疗提供新思路。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
sEVs摄取实验
验证hBMMSC sEVs能否被TM细胞摄取
PKH67标记sEVs，与TM细胞共培养12和24小时，通过共聚焦显微镜观察绿色荧光与细胞骨架共定位。
细胞增殖活性检测
评估TGFβ2和sEVs对TM细胞活力的影响
使用CCK-8试剂盒检测TGFβ2不同浓度（5、10、20 ng/mL）和sEVs不同浓度（10^6、10^8、10^10 particles/mL）处理24小时后的细胞活力。
2D培养TM细胞抗纤维化效果验证
检测sEVs对TGFβ2诱导的2D TM细胞纤维化的影响
Western blot、免疫荧光和qPCR检测FN、α-SMA及MMP相关基因表达。
3D培养TM细胞抗纤维化效果验证
检测sEVs对TGFβ2诱导的3D TM细胞纤维化及形态结构的影响
通过无支架3D培养TM细胞，免疫荧光检测FN和α-SMA表达，高内涵成像分析最大截面积、孔隙率和孔隙密度，AFM检测表面形态。
体内抗纤维化效果验证
评估sEVs对TGFβ2诱导的慢性高眼压小鼠模型眼压和TM纤维化的影响
注射Ad-TGFβ2C226/228S诱导高眼压，14天后前房注射sEVs，测量IOP并检测FN和α-SMA表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | 16000044 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| sEVs提取 | 去除sEV的血清 | Vivacell | C3801 |
| 磷酸盐缓冲液 | GENOM Bio | GNM14190-5 | |
| 0.22微米过滤器 | GREEN MALL | DS-ZSGLQ-02 | |
| sEVs鉴定 | 透射电子显微镜 | FEI | Tecnai |
| 纳米流式分析仪 | NanoFCM | U30E | |
| 抗CD9抗体 | BD Biosciences | 555371 | |
| 抗CD63抗体 | BD Biosciences | 561983 | |
| sEVs摄取实验 | PKH67染色剂 | Solarbio | D0031 |
| 罗丹明标记的鬼笔环肽 | Solarbio | CA1610 | |
| 含抗淬灭剂的DAPI | Cell Signaling Technology | 8961S | |
| 共聚焦激光扫描显微镜 | Carl Zeiss | LSM980 | |
| 细胞培养 | 地塞米松 | Sigma-Aldrich | D4902-25MG |
| 六孔板 | Corning | 3516 | |
| 96孔板 | Corning | CLS3599-100EA | |
| 细胞增殖实验 | 转化生长因子β2 | MedChemExpress | HY-P7119 |
| CCK-8试剂盒 | DOJINDO | CK04-500T | |
| 分光光度计 | Bio-Rad | -- | |
| Western blot | SurePAGE Bis-Tris凝胶 | GenScript | -- |
| 快速封闭液 | NCM Biotech | P30500 | |
| 抗肌纤蛋白抗体 | Abcam | ab318197 | |
| 抗α-SMA抗体 | Abcam | ab124964 | |
| 抗FN抗体 | Abcam | ab2413 | |
| 抗兔IgG HRP二抗 | Cell Signaling Technology | 7074S | |
| 免疫荧光 | 抗兔488荧光二抗 | Cell Signaling Technology | 4412S |
| 抗兔647荧光二抗 | Cell Signaling Technology | 4414S | |
| Triton X-100 | MP Biomedicals | 9036-19-5 | |
| qPCR | TaKaRa MiniBEST通用RNA提取试剂盒 | TaKaRa BIO | 9767 |
| PrimeScript RT试剂盒（含gDNA Eraser） | TaKaRa BIO | RR047A | |
| TB Green Premix Ex Taq II | TaKaRa BIO | RR420A | |
| QuantStudio 3实时荧光定量PCR系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 3D培养 | 胰酶 | Thermo Fisher Scientific | 25200056 |
| 甲基纤维素 | -- | -- | |
| 96孔球底板 | Corning | 4515 | |
| 3D形态分析 | 高内涵成像显微镜 | PerkinElmer | ImageXpress |
| 原子力显微镜 | Asylum Research | MFP-3D | |
| 悬臂梁 | Olympus | BL-AC40TS-C2 | |
| 动物实验 | 阿佛丁 | Sigma-Aldrich | -- |
| 盐酸丙美卡因滴眼液 | Alcon Couvreur NV | -- | |
| Ad-TGFβ2C226/228S腺病毒 | Dongze Bio | -- | |
| Ad-Null腺病毒 | -- | -- | |
| 妥布霉素眼膏 | -- | -- | |
| 眼压测量 | iCare TONOLAB眼压计 | iCare Finland Oy | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| sEVs提取与鉴定 | 超速离心转速和时间、sEVs粒径范围（40-160 nm）、CD9/CD63阳性比例（约70%至少一种阳性，>20%双阳性） 阅读提示：Methods: Extraction and Identification of hBMMSC sEVs |
| 2D细胞培养与处理 | TGFβ2浓度（20 ng/mL）、sEVs浓度（10^8 particles/mL）、处理时间（24小时） 阅读提示：Methods: Cell Proliferation Assay; Western Blotting; Immunofluorescence Analysis |
| 3D培养与处理 | 无支架3D培养条件：0.25%甲基纤维素、细胞密度1×10^6 cells/mL、培养6天后处理24小时 阅读提示：Methods: Construction of 3D Cultured hTMCs |
| 动物模型建立 | 腺病毒注射体积（2.5 µL）和滴度（1×10^8 pfu/mL）、sEVs注射体积和浓度（2.5 µL，108/mL）、注射时间（第14天） 阅读提示：Methods: Ocular Hypertension Animal Model and Drug Treatments |
| 眼压测量 | IOP测量时间点（第8天起每4天至第28天）、每次测量6次取平均值 阅读提示：Methods: IOP Measurement |