建立EAU小鼠模型
诱导实验性自身免疫性葡萄膜炎，模拟人类葡萄膜炎的病理过程。
雌性C57BL/6J小鼠经皮下免疫IRBP651-670肽（500 µg）并腹腔注射百日咳毒素（1 µg），建立EAU模型。
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麝香酮通过PI3K/AKT信号通路减轻葡萄膜炎
Muscone Attenuates Uveitis Through the PI3K/AKT Signaling Pathway
实验完整度
高体内EAU小鼠模型结合体外BV2细胞实验，包含功能验证（临床评分、病理评分、BRB破坏评估）和机制验证（蛋白质组学、Western blot、PI3K抑制剂）等至少两个证据层级。
主要模型
C57BL/6J小鼠EAU模型 BV2小胶质细胞系 EAU小鼠视网膜组织
重点核对
EAU模型：IRBP651-670肽500 µg免疫，并腹腔注射1 µg百日咳毒素 Muscone给药：EAU小鼠于免疫后第7天至第13天腹腔注射20 mg/kg，隔日一次 体外刺激：BV2细胞用LPS (1 µg/mL) + IFN-γ (100 ng/mL)处理24小时 PI3K抑制剂：LY294002浓度为10 µM，于免疫后第9天和第11天玻璃体腔注射 检测时间点：免疫后第14天进行临床评分和病理评分
摘要
目的：葡萄膜炎是一种免疫介导的眼部疾病，尤其对青壮年人群的视力构成严重威胁。葡萄膜炎的治疗因血视网膜屏障（BRB）的存在而变得复杂，该屏障限制了大分子药物进入眼内，从而限制了有效的治疗选择。本研究的主要目的是寻找一种能够治疗葡萄膜炎的新型治疗药物，并探讨其潜在机制。方法：在本研究中，我们使用了由光感受器间维生素A类结合蛋白（IRBP）诱导的实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）小鼠模型，以及脂多糖（LPS）和干扰素-γ（IFN-γ）诱导的炎症性BV2细胞。通过伊文思蓝和眼底荧光素血管造影（FFA）实验评估BRB的破坏情况。通过裂隙灯和蘇木精-伊红（H&E）染色评估炎症反应。通过体内蛋白质组学和Western blot研究潜在机制。结果：我们的研究表明，麝香酮显著减轻EAU并恢复BRB的完整性。此外，麝香酮处理显著下调视网膜和BV2细胞内的炎症因子。体内蛋白质组学结合液相色谱-质谱联用（LC-MS）已阐明，麝香酮通过调节PI3K-AKT信号通路发挥其抗炎作用。此外，通过使用LY294002特异性抑制PI3K，我们观察到EAU的炎症表型和BRB破坏显著减少。结论：总之，本研究确立了麝香酮对EAU进展的保护作用，并为其治疗作用的分子机制提供了见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 寻找能够治疗葡萄膜炎的新型治疗药物，并探讨其潜在机制。
- 核心机制
- 麝香酮通过抑制PI3K/AKT信号通路，减轻自身免疫性葡萄膜炎的炎症反应。
- 主要证据
- 在EAU小鼠模型中，麝香酮减轻了视网膜炎症并恢复血视网膜屏障完整性；在BV2细胞中抑制了M1型极化。体内蛋白质组学显示PI3K/AKT通路下调，Western blot证实p-PI3K和p-AKT水平降低。使用PI3K抑制剂LY294002进一步验证了该通路的关键作用。
- 研究意义
- 该研究为麝香酮作为治疗葡萄膜炎的新型治疗药物提供了实验依据，并揭示了其分子机制。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
麝香酮治疗EAU小鼠
评估麝香酮对EAU炎症的缓解作用。
EAU小鼠从免疫后第7天至第13天，隔日腹腔注射麝香酮（20 mg/kg），对照组注射含1% DMSO的生理盐水。第14天进行临床评分、病理评分、H&E染色、免疫荧光等检测。
评估血视网膜屏障（BRB）功能
检测麝香酮对EAU中BRB破坏的保护作用。
通过FFA和伊文思蓝染色评估血管渗漏，Western blot检测紧密连接蛋白Occludin的表达。
体外验证麝香酮对BV2细胞的影响
验证麝香酮在体外对LPS和IFN-γ诱导的BV2细胞炎症反应的影响。
BV2细胞用LPS和IFN-γ刺激，并用不同浓度麝香酮（0.1 µM和1 µM）预处理，检测细胞活力、增殖、迁移、炎症因子表达和一氧化氮水平。
机制研究：蛋白质组学和Western blot
探究麝香酮减轻EAU炎症的分子机制。
对EAU小鼠视网膜进行DIA蛋白质组学和LC-MS分析，筛选差异表达蛋白，并通过KEGG和GO分析富集通路，Western blot验证PI3K/AKT通路蛋白表达。
PI3K抑制剂验证
验证PI3K/AKT通路在EAU发病中的关键作用。
EAU小鼠在免疫后第9天和第11天玻璃体腔注射LY294002（10 µM），第14天评估炎症表型和BRB破坏。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | -- | |
| 无血清细胞冻存液 | Witcel | A401 | |
| 细胞冻存管 | A-GEN | -- | |
| 细胞处理 | 脂多糖 | PeproTech | -- |
| 干扰素-γ | PeproTech | -- | |
| 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 药物处理 | 麝香酮 | Selleck Chemicals | S3871 |
| 动物实验 | 荧光素钠盐 | Aladdin | -- |
| 药物处理 | LY294002 | MCE | -- |
| 免疫荧光 | 山羊血清 | Bio Channel Bio Technology | -- |
| IBA1抗体 | -- | -- | |
| Cy3标记二抗 | Beyotime | -- | |
| 血视网膜屏障评估 | 伊文思蓝 | Sigma-Aldrich | -- |
| 蛋白质组学 | 裂解缓冲液 | -- | -- |
| 胰蛋白酶 | -- | -- | |
| TMT试剂 | -- | -- | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | -- | |
| LC-MS分析 | 纳升高效液相色谱系统（U3000） | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Q-Exactive质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Xcalibur软件 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 细胞活力 | CCK8试剂 | TargetMol | C0005 |
| 细胞增殖 | EdU染色增殖试剂盒 | Beyotime | -- |
| Hoechst 33342 | Cytoch | 23491-52-3 | |
| 细胞迁移 | Transwell系统 | Corning | -- |
| 结晶紫 | Beyotime | -- | |
| Western blot | 裂解缓冲液 | Solarbio | R0010 |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| 快速封闭液 | Yeasen | -- | |
| ECL化学发光试剂盒 | Affinity | KF8001 | |
| 统计分析 | SPSS 27 | IBM Corp. | -- |
| Prism 9.0 | GraphPad | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| EAU模型诱导 | 小鼠品系、性别、年龄、免疫剂量（IRBP肽500 µg、百日咳毒素1 µg） 阅读提示：Materials and Methods - Induction of Experimental Autoimmune Uveitis |
| 药物治疗 | 给药剂量（20 mg/kg）、给药时间（第7天至第13天，隔日一次）、给药方式（腹腔注射） 阅读提示：Materials and Methods - Induction of Experimental Autoimmune Uveitis; Results - Muscone Alleviates Retinal Inflammation in EAU Mice |
| 体外细胞实验 | BV2细胞系、刺激条件（LPS 1 µg/mL，IFN-γ 100 ng/mL，24小时）、麝香酮浓度（0.1 µM和1 µM） 阅读提示：Materials and Methods - Cell Culture and Reagents; Results - Muscone Inhibits the M1 Polarization of Microglia In Vitro |
| PI3K抑制剂验证 | LY294002浓度10 µM、给药时间（第9天和第11天）、给药方式（玻璃体腔注射） 阅读提示：Materials and Methods - Intravitreal Injection; Results - PI3K Selective Inhibitor Attenuates EAU Inflammation |
| BRB评估 | 检测方法（FFA、Evans blue）、检测时间（第14天） 阅读提示：Materials and Methods - Assessment of the Blood-Retinal Barrier |
| 蛋白质组学 | 样本来源（视网膜）、标记方法（TMT）、LC-MS参数 阅读提示：Materials and Methods - Protein Preparation, Digestion, and Peptide Labeling; LC-MS Analysis |